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**产品**效果检验技术规范
日期：2025-04-30 11:06
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摘要：
**产品**效果检验技术规范
2.1.1 **剂杀微生物试验
2.1.1.1 适用范围
主要适用于**剂鉴定和日常监测，用来评价各种用途的**剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对**剂的**能力的重要方面进行验证，侧重反映**剂的实用剂量与**能力。不能反映**剂的**特性。
2.1.1.2 菌悬液与菌片的制备
2.1.1.2.1 适用范围
制备**剂**试验用**悬液与菌片，以供**剂**试验时使用。
2.1.1.2.2 试验器材
（1）菌种:金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326、白色葡萄球菌8032、白色***ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。在上述规定的菌株基础上，根据**剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。
（2）有机干扰物：见附录A。
（3）磷酸盐缓冲液：见附录A。
（4）无菌蒸馏水。
（5）稀释液：见附录A。
（6）**培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A。
（7）革兰染色液：见附录A。
（8）芽孢染色液：见附录A。
（9）恒温水浴箱。
（10）玻璃漏斗。
（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。
（12）数字可调移液器（10μl， 20μl， 100μl，200μl，1000μl）及配套用一次性塑料吸头。
（13）离心机。
（14）电动混合器
（15）浊度计。
2.1.1.2.3 **悬液制备程序
（1）**繁殖体悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养 18h～24h。挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。
2）取菌种第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0 ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使**悬浮均匀。
3）初步制成的菌悬液，先用**浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。
4）**繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
（2）**芽孢悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5 ml～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养 18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18h～24h，即为第3 代培养物。
2）用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3代～5代的18h～24h 营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养 5d～7d。
3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。
改良芽孢染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃条件下，加热 30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5% 沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。
4）罗氏瓶培养物，用10.0ml 吸管加10.0ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出**批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml 无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将**和**批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。
5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中 24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。
6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，**其中的琼脂凝块。
7）将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以3000 r/min 速度离心 30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。
8）将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。
9）将芽孢液放于80℃水浴中 10min（或60℃，30min），以杀灭残余的**繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。
10）芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。
11）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
2.1.1.2.4 菌片的制备程序
（1）**试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根据**对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、棉布等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为 10mm×10mm。当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将玻璃试管撞碎，故改用 12mm 直径圆形金属片（厚 0.5mm）。
（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：①将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30 min；②以自来水洗净；③用蒸馏水煮沸 10min；④用蒸馏水漂洗至 pH 呈中性；⑤晾干、熨平备用。
（3）布片用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规定的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制成的载体大小一致，且无毛边。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。
（4）载体经压力蒸汽**后，使用滴染法染菌。
染菌用菌悬液：使用TSB营养肉汤配制。**繁殖体，可直接使用经18h～24h培养的斜面培养物，**芽孢可使用4℃冰箱贮存液。含菌量约为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml，可使用浊度计调整菌液浓度。
滴染法染菌时，将经**的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为10μl。用10μl移液器接**塑料吸头滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内干燥（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。
（5）每个菌片的回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片。
2.1.1.2.5 注意事项
（1）用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告（如**试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量），必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。
（2）滴染时，菌液滴加量不宜过多，避免流散影响染菌的准确性。
（3）**繁殖体在烤干过程中，可引起部分死亡，如铜绿假单胞菌在37℃干燥过程中，滴度*高可下降1个对数值。此时，应提高初始菌浓度，以便达到所需的菌量。
（4）配制菌悬液和制备菌片时，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后**试验的结果。
（5）用带橡皮塞的容器保存菌液时，应将其预先煮沸10min 进行脱硫处理。
（6）制得的菌悬液和菌片，用毕应随时放入冰箱内，尽量减少在室温下放置时间，以减少**的自然死亡。
2.1.1.3 活菌培养计数技术
2.1.1.3.1 适用范围
测定**悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。
2.1.1.3.2 试验器材
（1）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。
（2）稀释液：见附录A。
（3）营养琼脂培养基：见附录A。
（4）电动混合器
2.1.1.3.3 操作程序
本规范要求在**试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。
（1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的**洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具体方法如下: 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。
（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、10-3......等。
（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取 0.5ml加至 10-1 管内。
（4）将 10-1 管依前法用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲80次），混匀，再吸取出0.5ml加入10-2管内。如此类推，直至*后一管。必要时，还可作某稀释度的1:1或1:4稀释。
（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 15cfu～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般需接种2个～3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。
（6）将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15ml～20ml。
（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养。
（8）每日观察**生长情况。培养至规定时间（**繁殖体为 48h，白色***与**芽孢为 72h），计数*终结果的菌落数。
（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留**剂等），而后取其*终样液按上法进行培养计数。
（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。但对黑曲霉菌活菌计数及杀灭试验时，平板菌落数应在15cfu～100cfu之间。
对估计菌量极少的样本（如**处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算*终结果。
将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu。
2.1.1.3.4 活菌计数中技术操作误差的测定
试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。对误差率的自检，可按以下公式计算。
（1）平板间误差率计算公式：
（2）稀释度间误差率计算公式：
2.1.1.3.5 注意事项
（1）严格无菌操作，防止污染。
（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。
（3）注意菌液的均匀分散。
（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。
（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。
（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。
（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45℃，以防损伤**或**。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利**分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。
（8）为提高试验成功率，*好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在**试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个稀释度）即有长菌在15cfu～300cfu 之间的平板。
（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。
2.1.1.4 残留**剂的去除方法
2.1.1.4.1 目 的
在化学**试验中，达到规定**时间终点时，要求立即终止残留**剂的继续作用，以便准确检测出**体系中残留存活的微生物及其数量。因为**体系中残留的**剂，可能对微生物的生长繁殖具有一定抑制作用，从而可导致对**效果偏高的错误判断，甚至产生假阴性结果。残留**剂的去除（下简称除药），可排除残留**剂对微生物的抑制，从而使试验获得正确结果。
2.1.1.4.2 除药的原则
（1）可有效去除残留的**剂。
（2）对微生物无害，不减少微生物应有的回收量。
（3）不破坏培养基的营养成份，不影响其透明度。
（4）必须按规定方法进行鉴定试验，并认为合格者方可在相应的**试验中使用。
2.1.1.4.3 除药的方法
（1）化学中和法：又称中和剂法，是指在**剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留**剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。本法同时含有稀释作用效果（至少1:1稀释，常用1:10稀释），是*为普遍使用的方法。
对常用**剂，虽有一些中和剂介绍，但在实际应用中由于情况多变，效果不一定都理想。所以，在**试验前仍应将拟用中和剂按试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点：①对接触**剂的微生物样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中；②所用中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同；③即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；④在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。
（2）过滤冲洗法
将经**剂作用过的微生物样本，立即加入适量稀释液中混匀（通过适量稀释，可减轻**剂的持续作用），并倾入装有微孔滤膜的滤器内，接真空泵抽吸过滤（或加压过滤）后，再加适量稀释液冲洗，同时过滤，可去除残留的**剂。多用于难以找到适宜中和剂的**剂试验中，如以植物提取物制备的**剂。本除**法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点：①准备好装有相应孔径微孔滤膜的滤器；②滤膜及滤器需先经**处理；③初次过滤后，应使用一定量对微生物无害的稀释液进行冲洗，冲洗次数一般以洗净**剂为准；④*后一次冲洗、滤净后，将微孔滤膜以无菌操作法取出，进行随后的培养检测。
（3）稀释法
将经**剂作用过的微生物样本，用稀释液稀释，降低残留**剂浓度，以消除对微生物的抑制作用。但若稀释过多，微生物浓度下降，可出现假阴性结果。本法可单独使用，但更常见的是与其它方法同时使用。单独使用时，一般多用于浓度系数较高的**剂（如醇类**剂）。本法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点：①对接触**剂的微生物样本，在达到规定作用时间后，即时以对微生物无害的稀释液稀释，稀释比例随试验需要决定；②电动混合或敲打振荡，使之混匀；③吸取稀释样液进行随后培养检测。
2.1.1.4.4 注意事项
（1）处理时应严守无菌操作要求，所有试液须无菌，接触样本和试液的器材（如吸管、平皿、试管、滤材等）亦均须经**，以免污染样本，影响试验结果。
（2）每次吸液，均须更换一支无菌吸管，以防交叉污染。此点由于操作繁琐，器材需求量大，往往不能认真执行，应加以注意。
（3）为保证试验的准确性，所用吸管的容量应尽量与拟吸取的液体量相近，不要用大吸管吸取少量液体；试验样本的混匀操作，必须认真进行；尽量减少中和剂或中和产物与试验微生物的接触时间。
（4）所用方法适宜与否，和**剂性质、复方中的附加成份、试验微生物种类、**试验种类等等均有关系，试验条件稍有改变就可能影响除药效果。故每进行一种**试验（包括**剂或微生物的更换），均需按规定对所选方法进行鉴定试验，合格者方可用于正式试验。此步骤绝不可省略，否则极有可能导致试验产生错误结果。
2.1.1.5 中和剂鉴定试验
2.1.1.5.1 目的
确定所选中和剂是否适用于拟进行的**和**杀灭试验。
2.1.1.5.2 试验器材
（1）试验菌菌悬液和菌片（见 2.1.1.2）。
（2）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。
（3）小平皿（4 cm～6cm 直径）。
（4）恒温水浴箱。
（5）稀释液：见附录A。
（6）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。
（7）电动混合器
2.1.1.5.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试**剂有良好的中和作用，对试验用**以及其恢复期培养是否有害或**影响。
（2）在确定用何种中和剂进行鉴定试验有困难时，可对多个中和剂进行初选以确定（见本款文后【附】）。
（3）试验中所用**剂的浓度应以**试验中使用的*高浓度为准。浓度过低，则不足以显示能否将高浓度**剂全部中和。
（4）鉴定试验中，**后去除残留**剂组（第2组）无菌生长，不能表明中和后受到**剂作用后的**是否能恢复生长。**是否复苏。此时可适当缩短作用时间重新进行试验，但作用时间*短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。若缩短作用时间后仍无菌生长，在排除其他原因的基础上，可适当下调**试验中**剂浓度，再次进行中和剂鉴定试验。
（5）同一**剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，应按微生物种类分别进行鉴定试验。对**繁殖体，在大肠杆菌（8099）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442）中任选其一进行试验即可；对**芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。
当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验。
（6）鉴定时根据所用**试验方法，使用相应的悬液或载体定量试验。
【附】中和剂初选试验
中和剂鉴定试验前，若难确定拟检测的中和剂，可通过本试验初选，而后以选中的中和剂进行正式的鉴定试验。初选操作程序如下：
（1）将0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～3×103 cfu/ml）加入含 4.5ml 中和剂试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。
（2）将0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～3×103 cfu/ml）加入含 4.5ml中和产物试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。
（3）试验同时设阳性对照组。阳性对照组以 0.5ml 菌悬液加入含 4.5ml 稀释液试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。
当3组平板上长出的菌落数接近，如果以阳性对照组为标准（X），前两组长菌数为（X±50%X）以内，可进行正式的鉴定试验。
2.1.1.5.4 试验分组
第1组 **剂 + 菌悬液→培养
观察**剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。
第2组 （**剂 + 菌悬液） + 中和剂→培养
观察残留**剂被中和后受到清毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。
第3组 中和剂 + 菌悬液→培养
观察中和剂是否抑菌。
第4组 （**剂 + 中和剂）+ 菌液→培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留**剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。
第5组 稀释液 + 菌悬液→培养
作为菌数对照。
第6组 稀释液 + 中和剂 + 培养基→培养
作为阴性对照。
2.1.1.5.5 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。将**剂按所需浓度配制好后，置20℃±1℃水浴中待用。
按2.1.1.2制备试验菌悬液。取2.0ml试验菌悬液于试管中，加入2.0ml有机干扰物质，制成含有机干扰物质的菌悬液，置20℃±1℃水浴中备用。
（1）第 1 组。吸取1.0ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃水浴中 5min 后，再吸加4.0ml**剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含有 4.5ml 稀释液的试管中，混匀。吸取该*终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
（2）第2组。吸取1.0ml含有机干扰物质试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml**剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含 4.5ml 中和剂溶液管中，混匀，作用10min。吸取该*终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
如平板生长菌落数均超过 300 个，应以稀释液对上述*终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。
（3）第 3 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，加入0.4ml硬水，混匀。加入4.5ml中和剂，作用10min。用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（4）第 4 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，吸加4.9ml中和产物溶液（以0.4ml**剂加4.5ml中和剂，作用 10min 配制而成）于试管内，混匀。作用10min，吸取该*终样液 0.5ml，用中和产物溶液做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（5）第5组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃ 水浴中5min 后，吸加0.4ml硬水于试管内，混匀。加入4.5ml稀释液，作用 10min ，用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（6）第 6 组。分别吸取稀释液、中和剂和硬水各1.0ml于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基25ml，培养观察。如出现**生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。
2.1.1.5.6 中和剂载体定量鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。
（1）第1组。吸取**剂5.0ml于无菌小平皿内，将其置20℃±1℃水浴中5min后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于**液中。待作用至试验预定的时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0ml稀释液试管中，作用10min。用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，吸取该*终样液 1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
（2）第 2 组。吸取**剂 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于**液中，待作用至试验预定时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打80 次。作用10min，吸取该*终样液1.0ml，分别接种于各平皿中，做活菌培养计数。
如平板生长菌落数均超过 300个，应重新吸取该*终样液 0.5ml，用稀释液做适当稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（3）第 3 组。吸取中和剂 5.0ml 于无菌小平皿中，将其置 20℃±1℃水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和剂内，作用 10min。立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0 ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打80 次，混匀。吸取该*终样液 1.0ml，用中和剂做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（4）第 4 组。吸取中和产物溶液（以一片浸有**剂的载体置 5.0ml 中和剂内，作用10min） 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用无菌镊子取出菌片，移入含 5.0ml 中和产物溶液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该*终样液0.5ml，用中和产物溶液做10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（5）第 5 组。吸取稀释液 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于稀释液中。作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 稀释液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该*终样液0.5ml，用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（6）第 6 组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现**生长，提示试验材料或操作过程中可能有污染。应重新进行试验。
2.1.1.5.7 评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
（1）第 1 组无试验菌，或仅有极少数试验菌菌落生长。
（2）第 2 组有较第 1 组为多，但较第 3、4、5（组）为少的试验菌菌落生长，并符合表 2-1 要求者。
表 2-1 中和剂鉴定试验合格标准中对第 1 组与第 2 组菌落数的要求
第 1 组平板平均菌落数 | 第 2 组平板平均菌落数 |
0 | >5 |
X（1～10） | >（X + 5） |
Y（>10） | >（Y + 0.5 Y） |
注：对抑菌作用不明显**剂（如乙醇）所用中和剂的鉴定试验中，当第 1 组与第 2 组菌落数相近，难以达到本表要求时，可根据具体情况另行作出判断和评价。
（3）第 3、4、5（组）有相似量试验菌生长，悬液试验在1×107cfu/ml～5×107 cfu/ml之间，载体试验在 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片 之间。其组间菌落数误差率应不超过 15%。第3、4、5 组间菌落数误差率计算公式其计算公式如下。
（4）第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。
（5）连续 3 次试验取得合格评价。
2.1.1.5.8 注意事项
（1）试验所分各组均有其特定意义，不得任意删减。
（2）严守无菌操作，保持试液和器材的无菌，注意更换吸管，以防止沾染影响试验的准确性。
（3）在计算微生物浓度时，须考虑其稀释倍数。
（4）试验组序应按本规范所列排列。
2.1.1.6 物理法去除残留**剂试验
2.1.1.6.1 目的
通过本鉴定试验，确定常用的物理去除法是否可去除**体系中残留的**剂，使**剂鉴定试验显示出真正的**效果。
2.1.1.6.2 试验器材
（1）过滤冲洗法需用经过**处理的滤器、微孔滤膜、真空泵（或抽滤泵）。
（2）离心沉淀法需用离心机与离心管。
（3）吸附柱、分子筛柱（主要供病毒灭活试验用）。
（4）无菌稀释液、冲洗液。要求不应影响除药材料（如滤膜、吸附柱等）的性质，对微生物无伤害作用。常用的有：水、缓冲液（如PBS）、稀释液、含0.1%～0.5%吐温80的PBS、中和剂（可中和部分**成分）。
（5）其他器材随所用试验微生物而定。
2.1.1.6.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所选方法是否对测试**剂有良好的去除作用，对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或**影响。
（2）试验中所用**剂的浓度应以**试验中使用的*高浓度为准。浓度过低不足以显示能否将高浓度**剂全部去除。
（3）鉴定试验中，**后去除残留**剂组无微生物生长，不能表明去除处理后**是否复苏。此时可增加处理时间或次数，亦可适当缩短作用时间再试。作用时间*短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。
（4）同一**剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用物理去除**剂法应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得互相取代。对**繁殖体的试验，可在大肠杆菌（8099）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442）或金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）中任选其一进行试验即可；对**芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。
当用其他特定微生物（如龟分枝杆菌脓肿亚种）进行杀灭试验时，均应以该特定微生物再次进行去除**剂方法的鉴定试验。
（5）鉴定中应根据正式杀灭试验的设计，选择使用悬液定量试验，还是载体定量试验。通常，悬液鉴定试验结果可用于载体试验。
2.1.1.6.4 物理去除方法的鉴定
（1）分组方法如下：
1）**剂 + 菌悬液→培养
观察**剂对试验菌有无杀灭或抑制作用。
2）（菌悬液 + **剂） + 过滤冲洗法处理→培养
观察所用去除**剂处理后，受到**剂作用后的试验菌是否能恢复生长。
3）（菌悬液 + 水）＋过滤冲洗法处理→培养
观察去除**剂处理是否影响试验菌的生长数量。
4）菌悬液→培养
作为菌悬液阳性对照值。
（2）操作程序如下：
1）第 1 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml**剂（应先置 20℃±1℃中水浴）于试管内，混匀，作用至试验预定时间。吸取该*终样液0.5ml，加于含4.5ml 稀释液试管中，混匀。吸取*终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数。
2） 第 2 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃水浴中 5min 后，再吸加4.0ml**剂于试管中，混匀。作用至试验预定时间，对其进行去除**剂处理，并取*终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。如平皿生长菌落数均超过300 个，应再吸取该*终样液 0.5ml，用 PBS 做适当稀释，选择适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数。
3） 第 3 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃水浴中 5min 后，再吸加4.0ml硬水于试管内，混匀。不加**剂，做同上处理。取*终样液 0.5 ml 用稀释液做 10 倍系列稀释，选择 2个～3个适宜稀释度悬液，各取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可先进行10 倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。
4）第 4组。吸取试验菌悬液 1.0ml，置含 4.0ml 稀释液的试管中，不加**剂，亦不作任何去除处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。
（3）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
1）第 1 组无试验菌，或仅有极少数生长。
2）第 2 组有远较第 1 组为多，但较第 3、4（组）为少的试验菌生长。在第 1 组无菌生长时，第 2 组平均每个平板（或滤膜）上生长菌落不少于 5 个。
3）第 3、4 （组）测定的结果，微生物数量应在 1×107 cfu/ml～5×107 cfu/ml 之间，其组间差不得超过两组回收菌数平均值的50%。组间差的计算可按下式进行:
4）连续 3 次试验取得合格评价。
5）本规范推荐使用过滤冲洗法。
2.1.1.6.5 注意事项 见 2.1.1.5.8。
2.1.1.7 **定量杀灭试验
2.1.1.7.1 目的
在实验室内测定**剂杀灭悬液中或载体上**繁殖体和**芽孢所需剂量，以验证实用**剂量。
2.1.1.7.2 试验器材
（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。此外，根据**剂特定用途或试验特殊需要，准备其他菌种的悬液或菌片。
（2）**剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。**剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯**剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方**剂浓度以主要**有效成分含量为准。各组**剂溶液有效成份浓度的计算，应以试验菌与**剂的混合液中有效成份的*终浓度为准。
（3）去除残留**剂的中和剂或设备（经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材）。
（4）**剂稀释用硬水：见附录A。
（5）有机干扰物质。悬液试验用3%BSA溶液，载体试验直接用TSB(见附录A)。
（6）TSA培养基：见附录A。
（7）含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（中和剂TSB），中和剂经鉴定合格。
（8）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。
（9）恒温水浴箱。
（10）喷雾器（用于喷雾**试验）。
（11）电动混合器。
（12）秒表。
2.1.1.7.3 试验分组
试验中应分以下各组：
（1）试验组。按测试目的有两种选择。
**种适用于**产品鉴定。根据本规范中表1-1和使用说明书，选定试验菌和一个**剂浓度（即产品使用说明书中指定的*低浓度）以及3个作用时间（说明书指定*短作用时间，指定*短作用时间的0.5倍，指定*低作用时间的1.5倍。如说明书指定*短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min三个时间）进行试验。
**种适用于**产品监督机构日常监测。根据所试菌种和**剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个**剂浓度（即产品使用说明书中指定的*低浓度）以及一个作用时间（说明书指定*短作用时间）进行试验。
（2）阳性对照组。根据各种试验的规定，用稀释液代替**剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数的初始浓度。
2.1.1.7.4 悬液定量**试验操作程序
（1）首先按产品说明书要求配制**液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的**液浓度为200mg/L，则应配制250mg/L），置20℃±1℃水浴备用。
（2）按照2.1.1.2 配制实验用菌悬液，浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml。
（3）取**试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置 20℃±1℃水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度**液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。
（4）待试验菌与**剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml试验菌与**剂混合液加于 4.5ml 经**的中和剂中，混匀。
（5）各管试验菌与**剂混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2 个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。
（6）同时用稀释液代替**液，进行平行试验，作为阳性对照。
（7）所有试验样本均在 37℃温箱中培养，对**繁殖体培养48h 观察*终结果；对**芽孢需培养 72h 观察*终结果。
（8）试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值:
杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）
计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果**试验组**处理后平均生产菌落数，小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。
2.1.1.7.5 载体浸泡**试验操作程序
（1）载体浸泡定量**试验操作程序
1）取无菌小平皿，标明所注入**液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸取相应浓度的**剂溶液注入平皿中。
2）将盛有**剂平皿置 20℃±1℃水浴箱内 5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于**液中。
3）待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的**被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。*终进一步混匀后，吸取 1.0ml 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。
4）另取一平皿，注入 10.0ml 稀释液代替**液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。
5）所有试验样本均在 37℃温箱中培养，对**繁殖体培养48h 观察*终结果；对**芽孢需培养 72h 观察*终结果。
6）试验重复 3 次（包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。
（2）载体浸泡定性**试验操作程序
1）取无菌小平皿，标明所注入**液的浓度。按每片5.0ml的量，吸取相应浓度的**剂溶液注入平皿中。
2）将盛有**剂平皿置20℃±1℃水浴箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片6片，（每个作用时间2片菌片）并使之浸透于**液中。
3）待试验菌与**液相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含5.0ml中和剂TSB试管中。用电动混合器混合20s，作为试验组样本。
4）另取一平皿，注入20.0ml硬水代替**液，放入4片菌片，作用至预定时间，取出2片，分别移入含5ml中和剂TSB试管中。其随后的试验步骤与上述试验组相同，作为阳性对照组样本。另取出2片，分别移入一含5.0ml中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲80次，然后用稀释液做10倍系列稀释，选择适宜稀释度，吸取1.0ml接种平皿，每管接种2个平皿，做活菌培养计数，作为菌数对照组样本。
5）所有试验样本均在37℃温箱中培养，对**繁殖体培养48h，观察*终结果；对**芽孢需培养7d，观察*终结果。
6）试验重复5次（包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片）。
2.1.1.7.6 载体喷雾定量**试验操作程序
（1）根据所试菌种和**剂对该菌的杀灭能力，选定1个**剂浓度（即产品使用说明书中指定的*低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定*短作用时间，指定*短作用时间的0.5倍，指定*低作用时间的1.5倍。如说明书指定*短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min 三个时间）进行试验。
（2）选定**剂的浓度与作用时间。每种菌所染菌片应分开进行试验。试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何**剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。
（3）每批试验以同一浓度**剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。
（4）待试验菌与**剂相互作用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上**被洗脱进入中和液中。
（5）吸取 1.0ml 上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管接种 2 个平皿。
（6）每批试验均应换一块未沾有任何**剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度**剂前，应将原残留**剂洗净，再换装新浓度**剂。
（7）用硬水代替**液，按同样的喷雾方法进行处理，作为阳性对照组。如为压力罐装自动喷雾式气雾**剂，可直接用染菌载体作活菌计数，作为处理前阳性对照组。
（8）所有试验样本均在 37℃温箱中培养，对**繁殖体培养48h 观察*终结果；对**芽孢需培养 72h 观察*终结果。
（9）试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。
2.1.1.7.7 定量**试验的评价规定
（1）产品监督检验，在产品说明书指定的*低浓度与*低作用时间，重复试验3次。要求悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可判定为**合格。要求载体定量杀灭试验，各次的杀灭对数值均≥3.00，可判定**合格。
（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3作用时间，重复试验3次。在产品指定*低浓度与*短作用时间，以及*短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均应≥5.00。要求载体定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均应≥3.00，可判定为**合格。在产品指定浓度与*短作用时间的0.5倍时，可容许对不同**或在部分重复次数中，出现不合格结果。
（3）对载体浸泡定性**试验，阳性对照组应有菌生长，菌数对照组符合要求，阴性对照组应无菌生长，5次试验所有作用时间均无菌生长为**合格。
（4）报告中应将各此试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次试验菌浓度，以及平均试验菌浓度。试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。
2.1.1.7.8 注意事项
（1）在**试验中，每次均应设置阳性对照。
（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。
（3）悬液定量**试验时，有机干扰物质一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到**体系中（稀释10倍），进行**试验。如果某**剂使用说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的**或只清洗**，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到**体系中（稀释10倍），进行**试验。
2.1.1.8杀灭分枝杆菌试验
2.1.1.8.1 目的
在实验室内测定**剂杀灭悬液中或载体上分枝杆菌所需剂量，以验证对分枝杆菌（包括结核杆菌）实用**剂量。
2.1.1.8.2 试验器材
(1)试验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326。
(2)培养基 分枝杆菌干燥培养基(上海奥普生物医药有限公司)。
(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备。
(4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。
(5) 稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液。
(6) **剂稀释用硬水：见附录A。
(7) 有机干扰物质：见附录A。
(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。
(9) 恒温水浴箱。
(10) 喷雾装置（用于喷雾**试验）。
(11) 电力混合器。
(12)计时装置。
(13) 恒温培养箱。
2.1.1.8.3 龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326 菌悬液的制备
（1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0mlMADC肉汤或罗氏肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养18h～24h。用接种环取第1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，于 37℃培养72h。挑取上述第 2代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，于37℃培养72h，即为第3代培养物。密封后，在4℃保存，时间不得超过6周。
（2）试验时取第3代斜面培养物，在分枝杆菌琼脂斜面上连续传代，培养方法与第3代相同。取第5代～6代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至一含有6-7g玻璃珠的无菌圆锥底试管中，在电动混合器混合至少5min。然后将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液。
（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。
（4）菌悬液保存在4℃冰箱内备用。当天使用不得过夜。
2.1.1.8.4 试验分组
试验分为下列各组:
(1) 试验组，按 2.1.1.7.3规定，选定**剂浓度与作用时间。
(2) 阳性对照组， 以硬水代替**剂溶液，按 2.1.1.7.3规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的初始浓度，并以其计算**因子对受试菌的杀灭对数值。
(3)阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。
2.1.1.8.5试验程序
常用杀灭试验有: 悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量**试验等。其操作程序详见2.1.1.7.4，2.1.1.7.5，2.1.1.7.6。接种后的平皿应放入干净的塑料袋内，在37℃中培养1周，观察*终结果。
2.1.1.8.6 评价规定
(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均≥4.00，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对分枝杆菌污染物**合格。
(2)产品鉴定检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3次，在产品使用说明书规定使用浓度与*短作用时间，以及*短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与*短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物**的有效剂量。
用载体浸泡定量杀灭试验评价**效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与*短作用时间，以及*短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定的使用浓度与*短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为试验室试验该产品对分枝杆菌污染物**的有效剂量。
2.1.1.9 **杀灭试验
2.1.1.9.1 目的
在实验室内测定**剂杀灭悬液中或载体上**繁殖体或**孢子所需剂量，以验证对**及其孢子实用**剂量。
2.1.1.9.2试验器材
(1) 麦芽浸膏琼脂（MEA）：见附录A。
(2) 沙堡琼脂培养基：见附录A。
(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备
白色***ATCC 10231 和黑曲霉菌ATCC 16404 或孢子悬液与菌片按 2.1.1.9.3(1) 和2.1.1.9.3(2) 所示方法制备。
此外，根据**剂特定用途和特殊需要，可选用其它**或孢子悬液与菌片。
（4）中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。
（5）磷酸盐缓冲液( PBS， 0.03 mol/L，pH7.2)。
（6）**剂稀释用硬水：见附录A。
（7）有机干扰物质：见附录A。
（8）刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。
（9）恒温水浴箱。
（10）喷雾装置（用于喷雾**试验）。
（11）电动混合器。
（12）计时装置。
2.1.1.9.3 **悬液制备
（1）白色***悬液的制备
1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于 37℃培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于 37℃培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过6周。
2）试验时，取第3代斜面培养物在砂堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代相同。取第5代或6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使白色***菌悬浮均匀。
3）悬液**试验时，实验用菌悬液的含菌量为1×107cfu/ml～5×107cfu/ml；菌片制备按2.1.1.2 要求进行。
4）菌悬液保存在 4℃冰箱内备用。当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2）黑曲霉ATCC16404 悬液或菌片的制备。
1) 取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细管吸取少量麦芽浸膏肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含5.0ml麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。用接种环划线接种第1代培养物于MEA培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养琼脂斜面培养基，置30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h，即为第3代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过9周。
2) 试验时，取第3代斜面培养物接种麦芽浸膏琼脂斜面，30℃培养48h，取得3.0~5.0ml麦芽浸膏肉汤，洗下斜面上的培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA培养基表面，然后吸弃多余肉汤培养物液体，置 30℃±1℃ 培养 7d～9d。
3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇1min 后，滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000r/min～6000 r/min，离心20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。
4) 黑曲霉分生孢子悬液在2℃～8℃储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。
5) 使用时，可用稀释液适当稀释。悬液试验时实验用菌悬液的含菌量为1×107cfu/ml～5×107 cfu/ml。
6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10μl。染菌后，置37℃培养箱内干燥(约 30min)，或置室温下自然阴干后再使用。
7)回收菌数应达5×105cfu/片～5×106cfu/片，可依试验要求确定。
2.1.1.9.4 试验分组
试验分为下列各组:
(1) 试验组，按2.1.1.7.3规定，选定**剂浓度与作用时间，对受试菌种的杀灭能力进行测定。
(2) 阳性对照组，以硬水代替**剂溶液，按2.1.1.7.3规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的初始浓度，并以其计算**因子对试验菌的杀灭对数值。
(3) 阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。
2.1.1.9.5 试验程序
常用杀灭试验有：悬液定量**试验、载体浸泡定量**试验、载体喷雾定量**试验等。培养基对白色***为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEA）。其操作程序详见2.1.1.7。
活菌培养计数时，对白色***，在37℃培养箱中培养48h 观察*终结果。对黑曲霉菌，在30℃培养箱中培养72h观察*终结果。
2.1.1.9.6 评价规定
(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验3 次，对白色***和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均≥4.00，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对**污染物**合格。
(2) 产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和3 个作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验在产品使用说明书规定使用浓度与*短作用时间，以及*短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与*低作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对**污染物**的有效剂量。
用载体浸泡定量杀灭试验评价**效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与*短作用时间，以及*短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定使用浓度与*短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为实验室试验该产品对**污染物**的有效剂量。
2.1.1.9.7 注意事项
(1) 黑曲霉菌试验操作应在Ⅱ级生物**柜内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。
(2) 其它注意事项见 2.1.1.7.8。
2.1.1.10 病毒灭活试验
2.1.1.10.1 适用范围
主要适用于**产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技
术，评价各种用途的**因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对**因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。
2.1.1.10.2 试验器材
（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。
（2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T**细胞白血病病毒 1 型（human T cellleukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人**细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。
（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。
（4）恒温水浴箱。
（5）二氧化碳培养箱。
（6）层流超净工作台。
（7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。
（8）液氮罐。
（9）倒置显微镜。
（10）离心机。
（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。
（12）细胞维持培养基：见附录A。
（13）细胞完全培养基：见附录A。
（14）去离子水。
2.1.1.10.3 病毒悬液的制备
（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于**试验。
（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中。
（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。
2.1.1.10.4 病毒灭活滴度计算方法
（1）终点稀释法病毒感染滴度的计算
以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。
TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例
（“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的*低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的*高组，下简称“低于50%组”）。
具体计算方法如下：
1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积〔见表 2-2〕。
各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）〔见表2-2〕。
2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：
3）计算举例
设试验数据如表 2-2
表 2-2 某**剂对 HIV 灭活作用的测定结果
样本 | 接种 | 细胞病变 | 累积值 | 病变比 | 病变率（%） | ||
稀释度 | 孔数 | - | + | 细胞病变(-) | 细胞病变(+) | ||
10-4 | 4 | 0 | 4 | 0 | 12 | 12/12 | 100 |
10-5 | 4 | 0 | 4 | 0 | 8 | 8/8 | 100 |
10-6 | 4 | 1 | 3 | 1 | 4 | 4/5 | 80 |
10-7 | 4 | 3 | 1 | 4 | 1 | 1/5 | 20 |
10-8 | 4 | 4 | 0 | 8 | 0 | 0/8 | 0 |
本例，高于 50% 组病变率（%）为80；低于50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为6。
TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5
（2）噬斑法病毒感染滴度的计算
噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见2.1.1.3）。
每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）＝ 平板平均噬斑数×稀释倍数
（3）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（**）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = log No－log Nx
2.1.1.10.5 残留**剂化学中和法的鉴定试验
（1）目 的
本鉴定试验只在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。
（2）试验设计原则
1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试****有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或**影响。
2）根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。
3）中和试验用**浓度应为正式**试验*高浓度。作用时间*短不得少于30s。
（3）试验分组
在使用细胞感染法进行病毒灭活试验时，对所用中和剂的鉴定，应进行以下各组试验。其中，先进行预备试验中的第 1组～3 组试验，如中和剂与中和产物对细胞生长无影响，再进行以下的正式试验。
预备试验:
1）中和剂 + 细胞→培养
观察所用中和剂对细胞的生长有无影响。
2）（**剂 + 中和剂）+ 细胞→培养
观察中和产物溶液对细胞生长有无影响。
3）（**剂 + 细胞）→培养
观察**剂对细胞生长有无影响。
正式试验:
1）**剂 + 病毒悬液→接种细胞培养
观察所试**剂对病毒有无抑制或灭活作用。
2）（**剂 + 病毒悬液） + 中和剂→接种细胞培养
观察残留**剂被去除后，病毒是否可恢复对细胞的感染作用。
3）中和剂 + 病毒悬液→接种细胞培养
观察中和剂对病毒有无抑制作用。
4）（**剂 + 中和剂） + 病毒悬液→接种细胞培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留**剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。
5）病毒悬液→接种细胞培养
观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。
6）未接种病毒的细胞→培养
观察其生长是否正常。
（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量有关器材，依次摆放，进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。各组每吸一次试剂或样本，即应更换一次吸管或微量移液器吸头，以防相互污染。
1）预备试验第 1 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度的中和剂溶液，作用3 h～4h 后，吸去液体，另加细胞维持培养液，置37℃二氧化碳培养箱中培养。
2）预备试验第 2 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度中和产物溶液作用3h～4h 后，吸去中和产物溶液，另加细胞基础培养液，置 37℃二氧化碳培养箱中培养。
3）预备试验第 3 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度的**剂，作用 3h～4h后，吸去**剂，另加细胞维持培养液，置 37℃二氧化碳培养箱中培养。
4）正式试验第 1 组。吸取双倍浓度**剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中 5 min 后，吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验预定的灭活病毒时间，加入1.0ml去离子水，根据试验规定量，吸取该*终样液（或以对病毒无害的稀释液作系列稀释），进行随后的病毒滴度测定。
5）正式试验第 2 组。吸取双倍浓度**剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中 5min 后，再吸加 0.5ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，加入 1.0ml 中和剂溶液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。
6）正式试验第 3 组。吸取 0.5 ml 去离子水于试管内，置 20℃±1℃水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用10 min，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
7）正式试验第 4 组。吸取双倍浓度**剂 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中 5 min 后，加入 1.0ml 中和剂，再吸加 0.5ml病毒悬液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。
8）正式试验第 5 组。吸取去离子水 1.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
9）正式试验第 6 组。将试验用细胞，加细胞维持培养液后，置37℃二氧化碳培养箱中培养。
10）本试验中对各种病毒的接种和检测操作技术，若无特殊要求，按病毒学中各种病毒的常规培养和检测方法进行即可。
（5）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
1）正式试验中第 1 组无试验病毒，或仅有少量试验病毒生长。
2）正式试验中第 2 组有较第 1 组显著为多，但较第 3、4、5（组）显著为少的试验病毒生长。
3）正式试验中第 3、4、5（组）病毒生长与原接种量相近。
4）正式试验中第 6 组细胞生长正常。
5）预备试验结果显示，中和剂和中和产物，在正式试验的*高浓度下对细胞生长无影响。
6）连续 3 次试验取得合格评价。
（6）注意事项
病毒载体中和试验法可参照上述悬液定量中和试验程序，并按照病毒学原理进行适当修改后使用。
2.1.1.10.6 残留**剂物理去除方法的鉴定试验
病毒灭活试验中的物理除药法，首先稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。
（1）分组
1）**剂 + 病毒悬液→接种培养
观察所试**剂对病毒有无灭活或抑制作用，对细胞正常生长有无影响。
2）（**剂 + 病毒悬液） + 除药处理→接种培养
观察去除残留**后病毒可否恢复对细胞的感染作用。
3）病毒悬液 + 除药处理→接种培养
观察除药处理对病毒滴度有无影响。
4）病毒悬液→接种培养
观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。
5）未接种病毒的细胞→培养
观察细胞生长是否正常。
（2）悬液定量操作程序
1）第 1 组。吸取**剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，根据试验规定量，吸取该*终样液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
2）第 2 组。吸**剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取*终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
3）第 3 组。吸取病毒悬液 0.1ml，加 0.9ml细胞基础培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取*终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
4）第 4 组。吸取病毒悬液 0.1 ml，加细胞维持液 0.9ml，不加**剂亦不做任何除药处理。根据试验规定量，吸取该病毒悬液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
5）第 5 组。向未接种病毒的细胞管内，加入完全细胞培养基培养。
（3）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格:
1）第 1 组无试验病毒，或仅有少量生长。
2）第 2 组有远较第 1 组为多，但明显较 3组～5组为少的试验病毒生长。
3）第 3、4、5 （组）试验病毒生长量相近。
4）连续 3 次试验取得合格评价。
5）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。
2.1.1.10.7 脊髓灰质炎病毒灭活试验
（1）目的
测定**剂对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）灭活所需的剂量，以验证病毒污染物**实用剂量。
（2）实验原理
用细胞感染法测定**剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算**剂对脊髓灰质炎的灭活率。
（3）试验分组
1）试验组。根据所测**剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。
2）阳性对照组。用去离子水代替**剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。
3）阴性对照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
（4）脊髓灰质炎悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于**试验。
2）取出低温冻存的脊髓灰质炎-1毒株，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。
3）取待测**剂，用**硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。
4）取100μl有机干扰物质与100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待检**剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出0.1ml，加入中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除**法处理。
5）阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替**剂。
6）各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。
7）试验重复3次。
8）终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞），在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。
9）噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后接种于细胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。
接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入1ml待测样品，放置37℃吸符1h～2h，倾出样液，加入含0.8%琼脂的细胞维持液3ml，冷却后翻转细胞瓶，放置37℃培养48h～72h。然后每瓶细胞加入2ml甲醛溶液固定数分钟，用自来水冲洗后加结晶紫溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫升测试样品中的病毒含量计算：
pfu/ml＝平板平均蚀斑数×稀释倍数
注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu～30pfu。
（5）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（**）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = log No－log Nx
（6）评价规定
1）脊灰病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学**剂对病毒的灭活效果。病毒的灭活滴度，应达到4个对数值。
2）在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7之间。
（7）注意事项
1）操作人员应具有基本的病毒学实验工作经验，尽量使用移液器与无菌一次性吸头。
2）在**试验中，每次均应设置阳性对照。
3）如使用病毒载体进行试验，可参照上述悬液定量试验程序，并遵照病毒学原理进行适当修改后使用。
2.1.1.10.8 艾滋病病毒灭活试验
（1）目 的
测定**剂对艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）灭活所需的剂量，以验证对该病毒污染物**实用剂量。
（2）实验原理
用细胞感染法测定**剂作用前后（或实验组与对照组）样本中HIV 的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算**剂对 HIV 的灭活对数值。
（3）**防护
试验中要求采取严密防护措施。我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物**三级（biological safety level3，BSL 3）实验室内进行，并制定有相应的**防护措施。在 HIV灭活试验时，必须严格按照有关**规定进行。
（4）试验分组
1）试验组。根据所测**剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设立适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。所设组应能测出使 HIV 全部灭活所需的*低有效剂量（**浓度与作用时间）。
2）阳性对照组。用去离子水代替**剂，按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养，观察 HIV 生长是否良好。
3）阴性对照组。用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
4）**剂对细胞毒性组。取 100μl 待测**剂，加入含有100μl 用完全培养基制备的MT4 细胞悬液（含细胞400 000 个/ml）的 96 孔培养板内。置二氧化碳温箱（37℃）中培养 7 d，观察细胞生长情况，确定**剂对细胞无毒性的*高稀释度。
（5）HIV 悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的 MT4 细胞，在 37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有 10ml 完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞对数生长期时收获细胞用于**试验。
2）从液氮中取出冻存HIV-1毒种，接种于含10ml细胞悬液（含细胞700 000个/ml～800 000个/ml）培养瓶中。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管 0.5ml 分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。如不能立即离心，可暂将培养瓶冷冻保存于-20℃，并争取尽快离心分装。
3）取待测**剂，用无菌去离子水作 1:2、1:4、1:8 ...系列稀释。视**剂的类型和实验目的，确定*高稀释度。为防止污染培养液，必要时在试验前需将**剂过滤**。
4）取 50μl 待检**剂，与 50μl 病毒原液混合。在规定温度作用一定时间（根据试验要求确定作用时间和温度），立即加入0.9ml 用完全培养基制备的MT4 细胞悬液（400000 个/ml），在37℃，放置40min，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替**剂；**剂对细胞毒性组试验中，用无菌去离子水代替病毒。
5）取出反应管，立即采取去除残留**剂处理。处理可用物理去除法或中和剂法（所用方法需先经试验证明，既可有效去除残留**剂，又对细胞和 HIV 无杀灭或抑制作用。
6）在 96 孔培养板上滴定样本中残留的病毒量。先在培养板（96孔）的各孔中，加入 100μl 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞 400 000 个/ml）。同时，用完全培养基对待滴定样本做 1：10系列稀释，然后取 100μl 稀释好的样本加入已含 MT4 细胞悬液的96孔培养板内。每个稀释度做 4 孔。
7）将按上述程序加液的 96 孔培养板，放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2），逐日在显微镜下观察细胞病变。被感染细胞融合肿胀，出现多核巨细胞。第 4d，在各反应孔内补加 50μl 新鲜完全培养基。第7d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
8）试验重复 3 次。
（6）评价规定
1）对测试滴度的HIV，3次灭活试验后均应不再检出，此时的灭活对数值应≥4.00，可判为该**剂浓度与作用时间，对HIV污染物**的实验室试验合格。
2）在正常情况下，HIV阳性对照组病毒感染滴度（TCID50）对数值应在5～7之间。阴性对照组宿主细胞生长良好，并且无HIV 检出。所用浓度的**液对宿主细胞生长无**影响。否则，根据发现的问题，或调整 HIV悬液浓度，或选择适宜**液浓度，或更换污染试剂和培养基，或改进其他有关条件后，重做试验。
（7）注意事项
1）操作人员应具有较丰富的病毒学实验工作经验，必须**遵守BSL3实验室的**制度。身体状态欠佳，或有伤口时，应暂时停止工作。
2）有感染可能性的操作，均应在BSL3实验室的层流负压超净工作台中进行。
3）一旦发生事故，有病毒感染或污染环境的可能时，切莫惊慌，除立即进行妥善**处理外，并应尽快报告实验室和单位领导。
4）本试验周期较长，在全部过程中应注意防止样本污染。
2.1.1.11 能量试验
2.1.1.11.1目的
测定连续加入**悬液对**剂**作用的影响，以验证该**剂用于多次**污秽物品(含较多有机物)，如浸洗拖布的**液、浸泡污染医疗器械的**液、浸泡洗手**液等实用剂量。
2.1.1.11.2 试验器材
(1) 试验菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 大肠杆菌 8099 铜绿假单胞菌 ATCC 15442
(2)磷酸盐缓冲液 (PBS，0.03mol/L，pH值7.2～7.4)。
(3)标准硬水(硬度为 342mg/L)：见附录A。
(4)含中和剂营养肉汤培养基 (所用中和剂应为经试验鉴定合格者，见 2.1.1.5)。
(5)**定量杀灭试验所用器材 (见 2.1.1.7.2)。
2.1.1.11.3试验程序
(1)试验用菌悬液配制 选择上述试验菌中对所试**剂抗力强者作为试验菌， 配制菌悬液。用标准硬水将酵母粉配成50mg/L溶液 (pH值6.9～7.1)。然后，吸取试验菌新鲜营养肉汤24h 培养物6.0ml，加于含 4.0ml酵母液试管中，混匀。依此配制成的菌悬液，所含菌量应为106 cfu/ml～107cfu/ml。
(2)将待测**剂用硬水稀释成A(1.5x)、B(x)、C(0.5x)等3 个浓度的**液 (括弧中的 “x” 代表**试验所得有效浓度)， 各取 3.0ml 分装于无菌试管内。
(3)第 1 次，取试验菌悬液 1.0ml 加入到第 1 管 A浓度**剂溶液内，立即混匀。
(4)在 A 管加菌悬液后8min，分别吸取A管内混合液20μl移种至A组的第1批5支盛有5.0ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。
(5)在第1次加菌悬液后10min，第2次取1.0ml菌悬液加入到A浓度**剂管内，立即混匀。
(6)在第2次加入菌悬液后8min(即第1次加菌悬液后18min)时，分别吸取 A 管内混合液20μl移种至 A 组的第2批5支盛有5ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。
(7)在第2次加入菌悬液后10min(即第1次加菌后20min)，取1.0ml 菌悬液加入到 A浓度**剂管内，振摇混匀。
(8)在第3次加入菌悬液后8min(即第1次加入菌液后28min)时， 分别吸取 A 管内混合液20μl移种至A组的第3批5支盛有5ml 含中和剂的营养肉汤培养基管中。
(9)B(x)、C(0.5x)两浓度药液的试验内容和操作程序，与上述A浓度者相同。3个稀释度**药液同一批进行操作时，可按表2-3规定的时间和顺序进行。
表2-3 能量试验操作时间
加菌与移种次序 各浓度组操作时间(第Xmin)
A B C
第 1 次加菌 0 1 5
第 1 次移种(5 管) 8 9 13
第 2 次加菌 10 11 15
第 2 次移种(5 管) 18 19 23
第 3 次加菌 20 21 25
第3 次移种(5 管) 28 29 33
(10)以2支含5ml中和产物 (用同次试验所用**剂与中和剂配制) 的营养肉汤培养基管，加入5μl试验菌液，作为阳性对照。
(11)以2支含 5ml与上相同的中和产物的营养肉汤培养基管，作为阴性对照。
(12)将以上各试验组和对照组样本管，置 37℃ 培养箱中培养 48h，观察是否有菌生长
(13)所有试验均在20℃±1℃ 水浴中进行。
(14)重复上述试验，每日1次，以连续取得3次同一评价结论者为准。
(15)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其长菌量应在106cfu/ml～107cfu/ml。阳性对照管应变浑浊，阴性对照，不应有菌生长。
对照组结果不符合要求时，应检查原因，改正后重新进行试验。
2.1.1.11.4 评价规定
当阳性对照管有**生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明)时，第 1 次和第 2 次移种的 5管样本中，有2 管或2管以上不长菌的浓度组，作为合格浓度组。如 3 个浓度组均合格， 应降低**剂浓度继续试验;反之，3个浓度组均不合格，则增加**剂浓度，直至找到*低合格浓度。连续3次重复试验，得到同样*低合格浓度，该*低合格浓度可作为设定反复浸泡用**液实用浓度的依据。
2.1.1.11.5 结果举例
设对某**剂能量试验结果如表2-4。
表 2-4 某**剂能量试验结果
试验序号 | **剂浓度 | 3 次加菌后移种 5 管肉汤中**生长情况 | ||||
(%，v/v) | (1) | (2) | (3) | |||
1 | 0.6 | ――――― | ＋＋＋＋＋ | ＋＋＋＋＋ | ||
1.2 | ――――― | ―＋＋＋― | ＋＋＋＋＋ | |||
1.8 | ――――― | ――――― | ――――― | |||
2 | 0.6 | ＋―＋＋＋ | ＋＋――＋ | ＋＋＋＋＋ | ||
1.2 | ――――― | ―――＋＋ | ＋＋＋＋＋ | |||
1.8 | ――――― | ――――― | ―――＋― | |||
3 | 0.6 | ――＋＋＋ | ＋＋―＋＋ | ＋＋＋＋＋ | ||
1.2 | ――――― | ＋―――― | ＋＋＋＋＋ | |||
1.8 | ――――― | ――――― | ――――― | |||
注: "+" 表示有菌生长， "-"表示无菌生长。
结论：此次试验结果，该**剂的*低合格浓度为1.2%。
2.1.1.11.6 注意事项
(1)试验应选用规定菌株。
(2)3 个**剂浓度组操作，应严格按表 2-3规定的时间进行。
2.1.1.12 各种因素对**剂**作用影响的测定
2.1.1.12.1 目 的
了解有机物、温度和 pH 对**剂**作用的影响规律，为制定**剂的实用剂量提供参考。
2.1.1.12.2 试验器材
（1）菌片与菌悬液（按 2.1.1.2 要求和方法制备）。
（2）恒温水浴箱。
（3）冷水浴装置（可放入试管架的容器，以冰水调节水温）
（4）温度计。
（5）pH 计。
（6）有机物，根据**剂的使用对象选择，如酵母粉、血清、蛋白胨。
（7）中和剂（经中和剂试验鉴定合格）。
（8）盐酸（用无菌蒸馏水配制）。
（9）氢氧化钠（用无菌蒸馏水配制）。
2.1.1.12.3 试验微生物的选择
根据所测**剂鉴定需要决定。一般情况下，除需用于特定微生物者外，对**繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，作为革兰阳性与阴性**的代表即可；用作**剂，可使用枯草杆菌黑色变种芽孢。
2.1.1.12.4 **液浓度和作用时间的设定
各种因素影响的测定，均用杀灭相应微生物试验所得*低有效浓度，和 3个～4个作用时间进行杀灭试验。在 3个～4个作用时间中，以该*低有效浓度所需的*短有效时间为第 1 时间（T），其后的第 2 时间为第 1 时间的一倍（2T）。依此，第 3 时间为 3T，第 4 时间为 4T。试验结果应根据需要测出杀灭对数值达 5.00（**用）的*低有效剂量。必要时，可根据需要调整**剂浓度或作用时间，若第 1 时间较长（> 30min），可根据情况适当缩短作用时间的组距。对第1时间较短者（＜5min），可根据情况适当延长作用时间的组距。
2.1.1.12.5 有机物对杀灭微生物效果影响的测定
（1）如以小牛血清为有机物代表，应设置无小牛血清对照组；含25% 小牛血清组；含 50% 小牛血清组等3组。各组所用**液浓度和作用时间，见2.1.1.12.4。
（2）以稀释液配制的微生物悬液与无菌小牛血清，按 1：1 与3：1 比例混合，分别配成含50%与25%小牛血清的微生物悬液。此含小牛血清的微生物悬液，可用于悬液定量**试验，亦可滴染菌片进行载体定量试验。
（3）试验中根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可参见2.1.1.7。
（4）其它有机物按此设计类推。各组试验应重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。
2.1.1.12.6 温度对杀灭微生物效果影响的测定
（1）设置10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃等，以10℃为间隔。各组所用**液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）对要求试验温度高于室温者，用恒温水浴箱（电热）调节；低于室温者用冷水浴装置（加适量冰水）调节。当上述温度调节装置到达要求温度后，放入装有试验样液的试管，同时放入一含与试验样液等量蒸馏水并插有温度计的试管。待试管内温度计指示到达试验所需温度时，开始随后的试验。
（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可分别参见2.1.1.7。
（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。
2.1.1.12.7 pH 对杀灭微生物效果影响的测定
（1）本项试验根据所测**剂使用溶液的 pH 值，分为以下 3 组进行：
第 1 组 pH 值 x - 2
第 2 组 pH 值 x
第 3 组 pH 值 x + 2
[例如，所测**剂使用溶液的 pH 值为 7.8，则 3 组的 pH 值应为：第 1 组 5.8，第 2 组 7.8，第 3 组 9.8]。
各 pH 组所用**液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）对**液 pH 的调节，先用 pH 计测定原**剂的pH，在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液，偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整。随时用pH 计测定**液的pH。当达到所要求的pH 后，停止调整，进行随后的试验。必要时，在pH 调整后可测定有效成分含量以观察是否受到pH 变化的影响。
（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序见 2.1.1.7。
（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。
2.1.1.12.8 评价规定
评价时，有机物影响试验应以不含外加有机物组（直接用稀释液配制微生物）的结果为对照；温度影响试验应以20℃±1℃ 组的结果为对照；pH 影响试验应以**剂使用溶液pH组的结果为对照。
（1）该组第 1个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果均合格，判为该组所试因素无影响。
（2）该组第 2个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有轻度影响。
（3）该组第 3个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有中度影响。
（4）该组只第 4 个作用时间的试验， 对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有重度影响。
（5）全部试验对所试微生物杀灭效果均不合格，判为本试验所试因素有严重影响。为取得**或**的有效剂量，需增加**液浓度或作用时间，重新进行试验。
2.1.1.12.9 注意事项
（1）本试验目的是为制定**剂实用剂量提供必要的参考数据，系统研究各种因素对**剂杀灭微生物效果的影响，尚需作更多系统的观察。
（2）为加强各组结果的可比性和可重复性，非观察因素应保持稳定不变。例如，在观察有机物的影响时，除有机物浓度根据需要改变外，其他如温度和pH等因素均应先后一致。
2.1.2 **剂模拟现场和现场**鉴定试验
2.1.2.1 **剂对食(饮)具**效果的模拟现场鉴定试验
2.1.2.1.1 目的
鉴定**剂对食(饮)具上**的杀灭作用，以验证该**剂对食(饮)具**的实用剂量。
2.1.2.1.2 试验器材
(1)大肠杆菌(8099)。对尚需用于杀灭其他特定**者，可增用该特定**进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。
(2))磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)
(3)稀释液：见附录A。
(4)中和剂(按2.1.1.5方法鉴定合格者)
(5)胰蛋白胨大豆琼脂培养基
(6)无菌棉拭
(7)规格板(用可略弯曲的软性材料制备，中央留一大小为5.0cm×5.0cm空格作为采样部位)。
(8)试验用食(饮)具样本 瓷碗（盘）或竹（木）筷前端（周长2.0cm， 长度为12.5cm。
2.1.2.1.3 操作程序
（1）按产品使用说明书的用法，选定本试验拟用浓度和作用时间，分别进行大肠杆菌杀灭试验。
（2）用无菌规格板在试验用瓷碗（盘）中间标出染菌区(5.0cm×5.0cm)。用无菌吸管吸取菌悬液，分别滴加于染菌区，每区0.1ml，用无菌L棒在区内涂匀，置37℃恒温箱干燥。
对筷子取前端12.5cm长度，蘸染预定量菌液后，并置37℃或室温干燥。
（3）试验组：将30个染菌碗或30个筷子样本，依次定时放入含**剂溶液的容器中，使其完全浸没。作用至规定时间后取出，弃掉**剂，向瓷碗（盘）内的染菌区加入5ml中和剂，用L棒刮洗染菌区，作用10min后，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将筷子放入含20ml~25ml中和剂的试管中，使其完全浸没在中和剂中，电动混匀器震荡60s或振敲200次，作用10min后，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将接种好的平皿放37℃恒温箱培养48h，计数菌落数，作为试验组。
（4）阳性对照组：将3个染菌碗或3只筷子样本不浸泡**剂，直接向瓷碗（盘）内的染菌区加入5ml中和剂，或直接将筷子放入含20ml~25ml中和剂的试管中。待试验组**处理完毕后，随试验组进行采样和检测。阳性对照组菌量应为1.25×107cfu/样本～1.25×108cfu/样本(相当于5×105cfu/cm2～5×106cfu/cm2)。
（5）阴性对照组：待试验组与阳性对照组试验结束后，将未用过的同批次中和剂、PBS接种培养基和未种菌的培养基等与上述两组样本同时进行培养，作为阴性对照。
（6）按下式计算每件食具上的生长菌落数。
每件食具样本生长菌落数（cfu/样本）=平板上平均菌落数×检测时样本稀释倍数
（7）计算杀灭对数值。
2.1.2.1.4 评价规定
以每种食（饮）具30个样本中大肠杆菌杀灭对数值均≥3.00所用**剂的浓度和作用时间为**合格剂量。
2.1.2.1.5注意事项
(1)试验操作过程必须采取严格的无菌技术。直接或间接接触样本的器材必须经**后 使用。模拟现场试验所用食(饮)具在染菌前亦必须经**处理。
(2)每次试验必须设置阳性和阴性对照，绝不可省略。
2.1.2.2 **剂对医疗器械的**模拟现场试验
2.1.2.2.1 目的
鉴定**剂对人工污染于医疗器械上**芽孢的杀灭作用作用，以验证对医疗器械处理的实用剂量。
2.1.2.2.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)
(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基
（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断，取其由轴至齿端部分，参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽**后，烤干备用)。
(6)塑料试管(1.8cm×18cm)。
2.1.2.2.3 操作程序
(1)以载体浸泡定量**试验进行**效果的测定。按产品使用说明书的剂量，选定本试验拟用浓度和和作用时间。
(2)染菌时，用无菌镊子将止血钳样本齿面朝上，并固定在无菌支撑物上。用0.1ml无菌吸管或定量无菌移液器，将0.02ml芽孢悬液滴染于齿部，用无菌L型铂金丝涂匀，置37℃恒温箱内干燥备用。
(3)取无菌平皿，按每个载体10ml用量加入**液，置20℃±2℃水浴中保温5min。
(4)将30个染菌样本浸没于**液中进行**处理。
(5)作用至规定时间，取出样本，分别移入含10ml中和剂溶液的塑料试管内。在手掌上振敲200次，分别取样液1.0ml倾注接种两个无菌平皿，放37℃恒温箱培养72h，计数菌落数，作为试验组。
(6)以无菌蒸馏水代替**液，将3个染菌样同样条件处理，然后与试验组样本同法进行活菌培养计数，作为阳性对照组，其菌量应在5×105 cfu/样本～5×106cfu/样本。
(7)试验结束后，将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基，进行培养;另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养，作为阴性对照。
2.1.2.2.4 评价规定
在规定作用时间内，阳性对照组均有菌生长，活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照均无菌生长时，以对试验组30个样本上人工污染芽孢的杀灭率对数均值≥3.00，可判为**合格。
2.1.2.2.5 注意事项
与本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。
2.1.2.3**剂对医疗器械的模拟现场**试验
2.1.2.3.1目的
用于验证**剂对人工染有芽孢的医疗器械**效果。
2.1.2.3.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)
(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基
（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断，取其由轴至齿端部分，参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽**后，烤干备用)。
(6)塑料试管(1.8cm×18cm)
2.1.2.3.3 操作程序
(1) 按产品使用说明书中的*低使用浓度与0.5倍*短作用时间。
(2) 25个染菌样本制备按2.1.2.2.3中(2)规定进行。
(3)无菌平皿，按每个载体10ml用量加入**液，置20℃±2℃水浴中保温5min。
(4)将20个染菌样本浸没于**液中进行**处理，作用至规定时间，将样本取出，分别放于含10ml中和剂肉汤的试管内（共20支），置37℃培养箱中定性培养7d，观察*终结果，作为试验组。有菌生长者，肉汤培养基呈轻度浑浊，有皱褶状菌菌膜，轻轻振摇可见絮状沉淀，无菌生长者肉汤清澈透明。
（5）以标准硬水代替**液，将2个染菌载体依上同样条件处理，然后与试验组载体同法接种、培养、观察结果，作为阳性对照组。
(6)另取3个染菌样本，分别放入10ml中和剂溶液塑料试管内。振荡1min，或在手掌上振敲200次，取样液进行活菌培养计数。培养72h计数菌落。作为菌数对照组，其菌量应为5×105cfu/样本～5×106cfu/样本。
(7)试验结束后，将用过的同批次中和剂、采样液和稀释液接种培养基，进行培养，另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养，作为阴性对照。
(8)试验重复3次。
2.1.2.3.4 评价规定
各次试验组所有60个样本均无菌生长，同时阳性对照组均有菌生长，菌数对照组活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照组均无菌生长时，可判定为**合格。
2.1.2.3.5注意事项
(1)**效果观察时，应严格无菌操作，否则可将**合格误判为失败。
(2)于本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。
2.1.2.4连续使用稳定性试验
2.1.2.4.1目的
验证**剂在反复取放浸泡医疗器械条件下的使用有效期。
2.1.2.4.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)
(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基：见附录A。
（5）试验样本[参照2.1.1.2.4（2）]。
(6)满载用医疗器械(选用医用剪刀、止血钳等小型器械，或根据需要选用其他器械。
(7)无菌带盖搪瓷盘。
2.1.2.4.3操作程序
(1)以枯草杆菌黑色变种芽孢为试验菌。
(2)试验时，配制双份2000ml**液，分别盛装于2个无菌带盖搪瓷盘中。各放入清洁的试验用医疗器械，使达满载要求。每次试验，同时分别对2个搪瓷盘中的**液进行检测。
(3)搪瓷盘内放入器械后，每日将器械取出，用清水洗涤，沥干，再回放入**液中。连续每日将器械取出、洗涤、沥干、再放入，直至试验结束。
(4)放入器械至说明书上连续使用的*长时间，吸取**液样本，医疗器械**按**剂对医疗器械的**模拟现场试验(2.1.2.2)，医疗器械**按**剂对医疗器械的模拟现场**试验（2.1.2.3）的方法，测定该**液对芽孢的杀灭效果。
2.1.2.4.4 评价规定
试验重复3次，以3次试验均达到合格要求，可判为连续使用稳定性试验合格。
2.1.2.4.5 注意事项
(1) 盛装**液的搪瓷盘，在每次操作完毕后应加盖。
(2) **效果观察时，应严格无菌操作，否则可将**合格误判为失败。
(3) 本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。
2.1.2.5 **剂对手**模拟现场试验
2.1.2.5.1 目的
用于测定**剂对人工污染于手表面**的杀灭作用，并作为确定该**剂对手**实用剂量的参考。
2.1.2.5.2 试验器材
（1）大肠杆菌8099或NCTC10538，对尚需用于杀灭其他特定**目的者，可增用该特定**进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。
（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。
（3）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。
（4）中和剂（以TSB为溶剂，经鉴定合格）。
（5）液体肥皂 200g/L。
（6）参考样品：正丙醇 60%（V/V）与异丙醇 60%（V/V）。
（7）标准硬水：见附录A。
（8）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。
（9）无菌纱布巾。
（10）吸管、试管、平皿若干。
（11）振荡混合器。
2.1.2.5.3 试验步骤
(1)菌悬液的制备 取2支在TSB中培养18h～24h的大肠杆菌培养物分别接种于1LTSB大三角烧瓶中，在36℃±1℃培养箱中培养18h～24h，用TSB将其稀释为2×108cfu/ml～2×109cfu/ml菌悬液。
（2）将12名～15名志愿者随机分为两组，**组使用参考样品，**组使用试验样品
（3）使用液体肥皂洗手1min 去除手表面污染的自然菌，然后用无菌纱布将手擦干。
（4）将2×108cfu/ml-2×109cfu/ml大肠杆菌的菌悬液放入一无菌容器中，
（5）将手掌中间到指尖部位浸入菌悬液中，手指分开，停留５s，将手离开菌悬液，在空气中干燥３min。
（6）干燥后立即将拇指与其他手指尖在含 10mlTSB的平皿中搓洗１min，取适当稀释度接种平皿。计数菌落数，作为试验前菌数。
（7）不再重复污染手，立即进行**处理。
（8）试验样品组：按说明书介绍的用量、作用时间和使用频率以标准的洗手方法（如图2-1）搓擦30s～60s（卫生手**）或*长5min（外科手**）。以流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。立刻将拇指与其它手指尖在含10ml中和剂的平皿中搓洗1min，做适当稀释后，分别取样液1.0ml以倾注法接种两个无菌平皿，放37℃恒温箱培养48h，计数菌落数。
(9)参考样品组：对于卫生手**，取60%异丙醇3 ml到入手心中，按标准的洗手方法用力搓擦30s。以确保手的所有部位均匀接触异丙醇。重复使用异丙醇按上述方法搓擦使总的搓擦时间为60s。对于外科手**，使用60%正丙醇3ml，按标准的洗手方法用力搓擦，当接近干燥时，再加3ml正丙醇搓擦。以保持作用3min。用流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。其余步骤与试验样品组相同。
1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦
4.两手互握互搓指背 5.拇指在长中转动搓擦 6.指尖在掌心中摩擦
图2-1 标准的洗手方法
(10) 在试验当日，**组与**组样品对换，重复上述试验。
(11) 分别计算参考样品组和试验样品组的菌数减少的对数值。
2.1.2.5.4 评价规定
(1) 试验样品的杀灭对数值大于或等于参考样品的杀灭对数值为合格。
(2) 若试验样品的杀灭对数值小于参考样品的杀灭对数值，应进行统计学处理，以确定差异是否显著。
(3) 若试验样品的杀灭对数值不显著小于参考样品的杀灭对数值，可判为**合格。若试验样品的杀灭对数值显著小于参考样品的杀灭对数值，表明该试验样品不符合本规范的要求。
2.1.2.5.5注意事项
（1）试验必须在同一受试者、同**、相同环境、同样条件下进行，使试验样品和参考样品的结果具有可比性。
（2）所有受试者应年满18岁，身体健康。手部皮肤应无破损、无皮肤病，手指甲短而干净。
（3）试验用菌悬液应在第1只手浸入后3h内使用。在1次试验中，无论使用试验样品还是参照样品，所有受试者手的染菌都应使用同一批菌悬液。
（4）对受试者，在每次试验结束时，应及时对双手进行彻底的**处理。
2.1.2.6**剂对手**现场试验
2.1.2.6.1目的
测定**剂对手表面自然菌**所需使用的剂量，以验证该**剂对手**实用剂量。
2.1.2.6.2试验器材
（1）中和剂（中和剂经鉴定合格)
（2）无菌棉拭
（3）稀释液 0.1%吐温80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2
（4）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。
（5）标准硬水：见附录A。
（6）无菌纱布巾
（7）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。
（8）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。
（9）振荡混合器
（10）吸管、试管、平皿若干。
2.1.2.6.3试验步骤
(1)在使用现场，随机选定受试者。试验不少于30人次。
(2)**前，在受试者双手相互充分搓擦后，让受试者左手指并拢，用无菌棉拭在含10ml稀释液试管中浸湿，于管壁上挤干后，在五指屈面指尖至指根，往返涂擦2遍，每涂擦一遍，将棉拭转动一次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入中和剂试管内，作为阳性对照组样本。
(3)根据**剂使用说明书的方法对右手进行**，对手的卫生**一般设定作用时间为1min，对外科洗手后的泡手一般设定作用时间为3min。**后用中和剂代替稀释液，与阳性对照组同样的方法对受试者右手上残留的自然菌采样一次，作为试验组样本。
(4)分别将未用过的同批中和剂、稀释液各1.0ml、棉拭1份～2份作为阴性对照组样本。
(5)分别取试验组、阳性对照组和阴性对照组样本各1ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察*终结果。
(6)计算杀灭对数值
2.1.2.6.4评价规定
阳性对照组应有较多**生长，阴性对照组应无菌生长，以对30人次手上自然菌的平均杀灭对数值≥1.00可判为**合格。
2.1.2.6.5注意事项
(1)本试验需有志愿者参与，重复人次较多，一人可多次受试，但不得在一批试验或同日反复参与，否则可影响结果的准确性。
(2)受试者接受试验时，不得触摸任何表面，以免使手的试验部位沾染杂菌。
(3)棉拭涂抹采样，较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量， 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致。
(4)擦拭**时，涂药量要适宜，涂抹要均匀。
(5)现场样本须及时检测，室温存放不得超过2h。否则应放4℃冰箱内，但亦不得超过4h。
2.1.2.7消毒剂对皮肤消毒模拟现场试验
2.1.2.7.1 目的
测定**剂对人工污染于皮肤表面**的杀灭作用，以验证该**剂对皮肤**实用剂量。
2.1.2.7.2试验器材
（1）试验菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 27217，对尚需用于杀灭其他特定**者，可增用该特定**进行试验。
（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），见附录A。
（3）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。
（4）中和剂（中和剂经鉴定合格）。
（5）液体肥皂 200g/L。
（6）金属筒 （直径2.2cm、高度3cm）。
（7）尼龙刮菌棒。
（8）无菌纱布巾。
（9）吸管、试管、平皿若干。
（10）振荡混合器。
（11）一次性接种环（直径4mm）。
（12）***软膏。
（13）皮肤**剂。
（14）恒温箱。
2.1.2.7.3试验步骤
（1）菌悬液的制备按2.1.1.2.3规定的方法和要求进行。
（2）使用液体肥皂清洗受试者前臂内侧1min，用自来水冲净残留皂液，然后用无菌纱布擦干，以去除前臂内侧表面污染的自然菌。
（3）用一端醮有印墨直径为3.0cm的玻璃筒扣印在受试者的每只前臂中段（不要在手腕和肘皱褶处），划分出一个试验区。
（4）使用加样器取10μl上述菌悬液，接种于前臂试验区（使回收菌落数为2×106cfu/试验区～1×107cfu/试验区），用一次性接种环，把菌悬液涂成一圆形，与试验区边缘应有4mm～5mm的距离，在空气中自然干燥。
（5）根据**剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行**，一般设定作用时间为1 min～3min。
（6）**后用中和剂对前臂上接种的区域进行取样。采样时，将金属筒放置于试验区中间部位，罩住染菌区，不要接触到盖有印墨的边缘。将1.0ml中和剂吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤60s，将筒内液体吸移至试管内，再加1.0ml中和剂对该区域内的皮肤进行**次刮洗30s，将**次擦洗的液体，注入含**次刮洗液体的试管中，作为试验组样本。
（7）以蒸馏水代替**剂对左前臂中段做同样处理，作为对照组样本。
（8）每次试验分别将未用过的同批中和剂、稀释液各1.0ml作为阴性对照组样本。
（9）分别取适宜稀释度试验组、对照组样本和阴性对照组样本各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察*终结果。
（10）计算杀灭对数值。
（11）试验不得少于15人次。
2.1.2.7.4．评价规定
对照组回收菌落数为2×106cfu/试验区～1×107cfu/试验区，阴性对照组应无菌生长，且对每一人次皮肤表面人工污染的金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均≥3.00可判为**合格。
2.1.2.7.5注意事项
（1）受试者录用标准
1）年龄介于18岁至65岁的男性或女性；
2）受试者应身体健康；
3）前臂皮肤应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题。
（2）排除受试者的标准，如果受试者有下列情况之一，不能被录用参加试验
1）怀孕妇女；
2）诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV阳性）、器官移植者。
（3）试验采样结束后，先用70%的酒精对受试者前臂进行**，然后用皮肤**剂对两只前臂进行**处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的***软膏于试验区，以防****。
（4）在试验完成后的48h至72h内，受试者如发现前臂上有小**、水疱，隆起的红色痒疱，应及时通知检验单位。
2.1.2.8**剂对皮肤**现场试验
2.1.2.8.1目的
测定**剂对皮肤表面自然菌**所需使用的剂量，以验证该**剂对手**的实用剂量。
2.1.2.8.2试验器材
（1）中和剂（中和剂经鉴定合格）。
（2）无菌棉拭。
（3）稀释液 0.1%吐温80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液pH7.2。
（4）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。
（5）标准硬水：见附录A。
（6）无菌纱布巾。
（7）规格板(用牛皮纸制备，中央留一3.0cm×10.0cm的空格作为采样部位)121℃15min**备用。
（8）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）。
（9）振荡混合器。
（10）吸管、试管、平皿若干。
2.1.2.8.3试验步骤
(1)在使用现场，随机选定受试者。试验不少于30人次。
(2)**前，让受试者将左右前臂内侧中段相互充分对搓后， 将规格板放于受试者左前臂内侧中段表面，用无菌棉拭在含10ml稀释液试管中浸湿，于管壁上挤干后，在规格板框定的区域内，横向往返涂擦10遍，纵向往返涂擦3遍，每涂擦一遍，将棉拭转动一次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入采样液试管内，振打200次。
(3)根据**剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行**，一般设定作用时间为1min～3min。**后用中和剂代替稀释液，与阳性对照组同样的方法对受试者右前臂内侧表面残留的自然菌采样一次，作为试验组样本。
(4)分别将未用过的同批中和剂、稀释液和棉拭作为阴性对照组样本。
(5)分别取适宜稀释度的试验组、阳性对照组和阴性对照组样本各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察*终结果。
(6) 计算杀灭对数值
2.1.2.8.4评价规定
阳性对照组应有较多**生长，阴性对组应无菌生长，以对30人次批皮肤表面自然菌的平均杀灭对数值≥1.00，可判为**合格。
2.1.2.8.5注意事项
(1)本试验需有志愿者参与，重复人次较多，一人可多次受试，但不得在一批试验或同日反复参与，否则可影响结果的准确性。
(2)受试者接受试验时，不得触摸任何表面，以免使试验部位沾染杂菌。
(3)棉拭涂抹采样，较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量，以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致。
(4)擦拭**时，涂药量要适宜，涂抹要均匀。
(5)现场样本须及时检测，室温存放不得超过2h。否则应放4℃冰箱内，但亦不得超过4h。
2.1.2.9 **剂对其它表面**模拟现场鉴定试验
2.1.2.9.1 目的
用于鉴定**剂对人工污染于一般物体[指除本规范已有专门规定如食(饮)具、医疗器械等以外的物体]表面**的杀灭作用，以验证该**剂对上述表面**的实用剂量。
2.1.2.9.2 试验器材
(1) 大肠杆菌(8099)与金黄色葡萄球菌(ATCC6538)。如需用于杀灭其特定微生物者，可增用该特定微生物进行试验。菌悬液制备，按2.1.1.2规定的方法和要求进行，检测菌量应在1.25×107 cfu/样本～1.25×108 cfu/样本(相当于5×105cfu/cm2～5×106cfu/cm2)。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)
(3) 稀释液(含0.1%吐温80的PBS溶液)
(4) 中和剂(按2.1.1.5方法鉴定合格者)
(5) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
(6) 无菌棉拭
(7) 规格板(用不锈钢材料制备，中央留一5.0cm×5.0cm的空格作为采样部位)
2.1.2.9.3试验步骤
(1)以人工染菌实物如桌面、地面、墙壁等为**对象。在无特殊要求情况下，可用木制桌面为代表，进行**效果观察。
(2)每次试验，各类物品表面测试30个样本。
(3)染菌时，选物品较平的部位，于规格板中央空格内用无菌棉拭沾以菌悬液均匀涂抹被试表面的60个区块(各为25cm2)。待自然干燥后进行试验。30个区块作为阳性对照区，30个区块为试验区。
(4)阳性对照组：将无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿，对30个对照组区块涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内，振打200次，作用10min。用稀释液做适当稀释。
(5)试验组：根据说明书中介绍的使用剂量将**剂喷雾或涂擦于物体表面进行**。**后，将无菌棉拭于含5ml中和剂试管中沾湿，分别对30个**区块进行涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原中和剂试管内，振打200次，作用10min。必要时用中和剂作适当稀释。
(6)试验结束后，将用过的同批次中和剂、稀释液各1.0ml接种培养基，作为阴性对照组样本。
(7)将阳性对照组、阴性对照组和**组样本，每份吸取1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察*终结果。
(8)计算杀灭对数值。
2.1.2.9.4评价规定
试验重复3次，阳性对照组菌数符合要求，阴性对组无菌生长，所有样本的杀灭对数值均≥3.00，可判为**合格。
2.1.2.9.5注意事项
(1)试验操作必须采取严格的无菌技术。
(2)每次试验均需设阳性和阴性对照，绝不可省略。
(3)**前后采样(阳性对照组和**试验组)，不得在同一区内进行。
(4)棉拭涂抹采样较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量，洗菌时敲打的轻重等等先后一致。
(5)现场样本须及时检测。室温存放不得超过2h，否则应置4℃冰箱内，但亦不得超过4h。
2.1.2.10 **剂对其它表面**现场鉴定试验
2.1.2.10.1目的
用于鉴定**剂对一般物体[指除本规范已有专门规定如食(饮)具、医疗器械等以外的物体]表面自然菌的杀灭作用，以验证**剂对上述表面**的实用剂量。
2.1.2.10.2 试验器材
(1)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)
(2)中和剂
(3)稀释液(含0.1%吐温80的PBS溶液)
(4)无菌棉拭
(5)规格板(用不锈钢材料制备，中央留一 5.0cm×5.0cm的空格作为采样部位)
(6)胰蛋白胨大豆琼脂培养基
2.1.2.10.3操作程序
在使用现场，按说明书介绍的用量、作用时间、使用频率和**方法**物体表面，检测样本数应≥30份。
(1)随机取物体表面(桌面、台面、门等)，用规格板标定2块面积各为25cm2的区块，一供**前采样，一供**后采样。
(2)**前，将无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿，对一区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内，震荡20s或振打80次，做适当稀释后，作为阳性对照组样本。
(3)根据规定的剂量，将**剂喷雾或涂擦于物体表面进行**。**后，将无菌棉拭于含5ml中和剂试管中沾湿，对**区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原采样液试管内，电动混匀器震荡20s或振打80次，作为**组样本。
(4)试验结束后，将用过的同批次中和剂、稀释液各1.0ml接种培养基，作为阴性对照组样本。
(5)将阳性对照组、阴性对照组和**组样本，每份吸取1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察*终结果。
(6)计算杀灭对数.值。
2.1.2.10.4评价规定
试验重复3次，阳性对照组应有较多**生长，阴性对组应无菌生长，**样本的平均杀灭对数值 ≥1 ，可判为消毒合格。
2.1.2.10.5 注意事项：
(1)在现场试验中，自然菌的种类较复杂，平板上常出现大面积霉菌生长，导致无法计数菌落。此时，在两个平行的平板中如有一个平板可数清菌落数，即按该平板菌落数计算结果。如两平板均有大面积霉菌生长，应重新进行试验。
(2)试验操作必须采取严格的无菌技术。
(3)每次试验均需设阳性和阴性对照，绝不可省略。
(4)**前后采样(阳性对照组和**试验组)，不得在同一区块内进行。
(5)棉拭涂抹采样较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量， 洗菌时敲打的轻重等等先后一致。
(6)现场样本须及时检测。室温存放不得超过2h，否则应置4℃冰箱内，但亦不得超过4h。
2.1.3 空气**效果鉴定试验
2.1.3.1 目的
检测**器械或**剂对空气中**的杀灭和(或)**作用，以验证其对空气的**效果。其他方法对空气的**效果，亦可参照本试验的有关原则进行。
2.1.3.2 试验设备和器材
(1) 试验菌为白色葡萄球菌8032，其菌悬液的制备方法见 2.1.1.2。
(2)采样液[用于液体撞击式采样器采样。非化学因子**试验时，用含抗泡沫剂（辛醇或橄榄油）的营养肉汤培养基；**剂**试验时，用含相应中和剂的营养肉汤培养基（同样加入辛醇或橄榄油）]。
(3) 中和剂( 按 2.1.1.5 方法鉴定合格者)。
(4) 磷酸盐缓冲液( PBS，0.03 mol/L，pH 7.2 )。
(5) 普通营养肉汤培养基。
(6) 普通营养琼脂培养基。**剂**试验时，尚需在其中加入相应的中和剂。
(7) 相邻的一对气雾柜或气雾室，一个用于**试验，一个用于试验对照。一对气雾柜或气雾室所处环境(包括温度、湿度、光照、密闭性、和通风条件等)应一致。柜(或室)宜以铝合金和玻璃构建。应安装温度和湿度调节装置以及通风机过滤**或其它**装置和相应管道，此外，还应开设供喷雾染菌、给**剂、采样等的袖套操作和样本传递等窗口。
(8) 喷雾染菌装置，包括空气压缩机、压力表、气体流量计和气溶胶喷雾器等。喷出**气溶胶微粒的直径 90% 以上应在 1μm～10μm 之间。
(9) 空气微生物采样装置，包括六级筛孔空气撞击式采样器、液体撞击式采样器、抽气设备、气体流量计等。
(10) 环境监测器材，如温度计、湿度计等。
2.1.3.3 试验阶段
空气**试验分为实验室试验、模拟现场试验与现场试验。三个阶段试验的特点见表 2-5。
2.1.3.4 实验室试验与模拟现场试验操作程序
(1) 取试验菌菌悬液，用无菌脱脂棉过滤后，再用营养肉汤培养基稀释成所需浓度。
(2) 同时调节两个气雾柜(或室)的温度、相对湿度至试验要求的温度和相对湿度。
(3)将使用的器材一次放入气雾柜(或室)内，将门关闭。此后，一切操作和仪器设备的操纵均在柜(或室)外通过带有密封袖套的窗口或摇控器进行。直至试验结束，始可将门打开。
(4) 按设定的压力、气体流量及喷雾时间喷雾染菌。边喷雾染菌，边用风扇搅拌。喷雾染菌完毕，继续搅拌 5 min，而后静置 5min。
（5）同时对对照组和试验组气雾柜(或室)分别进行**前采样，作为对照组试验开始前和试验组**处理前的阳性对照(即污染菌量)。气雾柜(或室)内空气中各阳性对照菌数应达5´104cfu/m3～5´106 cfu/m3。
表 2-5 各阶段空气**试验的特点
项 目 实验室试验 模拟现场试验 现场试验
目 的 测定*低有效剂量 测定*低有效剂量 验证实用**效果
试验柜(室) ≥1m3柜 10m3～20m3室 ≥20m3房间
采样器 液体撞击式 六级筛孔空气撞击式 六级筛孔空气撞击式
菌 株 白色葡萄球菌 白色葡萄球菌 空气中自然菌
试验菌雾粒 <10μm <10μm 不 定
温 度 20℃～25℃ 20℃～25℃ 自然条件
相对湿度 50%～70% 50%～70% 自然条件
中和剂 加于采样液中 加于采样培养基中 加于采样培养基中
对 照 需有自然消亡对照 需有自然消亡对照 不需自然消亡对照
结果计算 杀灭率 杀灭率 消亡率
在模拟现场试验时，用六级筛孔空气撞击式采样器采样，采样时，将六级筛孔空气撞击式采样器放在柜室中央1m高处(采样方法按采样器使用说明书进行)。在实验室试验时，用液体撞击式采样器采样，采样器置柜内中央处。
(6)按产品说明书规定的方法，在试验组气雾柜(或室)内进行**。对照组气雾柜室同时作相应(不含**剂)处理。
(7)作用至规定时间，对试验组和对照气雾柜(或室)按前述方法同时进行采样。继续作用至**个预定**时间，再次按前述方法进行采样。如此按作用时间分段采样，直至规定的*终作用时间为止。
(8) 在实验室试验阶段，用液体撞击式采样器采集的样本，按2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数，在 37℃ 培养箱内培养 48h，观察*后结果。
(9) 在模拟现场试验阶段，用六级筛孔空气撞击式采样器采样时，采样平板直接放入 37℃ 培养箱中培养 48 h，观察*后结果，计数生长菌落数。
(10)全程试验完毕，对气雾柜（室）表面和空气中残留的**做*终**后，打开通风机，过滤**排风，排除柜(或室)内滞留的污染空气，为下一次试验作好准备。
(11) 在完成试验组与阳性对照组采样和样本接种后，应将未用的同批培养基、采样液和PBS 等(各取1份～2份)，与上述两组样本同时进行培养或接种后培养，作为阴性对照。若阴性对照组有菌生长，说明所用培养基或试剂有污染，试验无效，更换无菌器材重新进行。
(12) 同一条件试验重复 3 次，每次均分别计算其杀灭率。3 次结果的杀灭率均≥99.90% 时，可判为**合格。杀灭率的计算方法如下:
Nt:空气中**的自然消亡率;
V0 与 Vt:分别为对照组试验开始前和试验过程中不同时间的空气含菌量;
Kt:**处理对空气中**的杀灭率;
V0'与 Vt':分别为试验组**处理前、和**过程中不同时间的空气含菌量。
**前后空气中的含菌量按下列公式计算：
[ 举例:用某**剂对气雾柜内空气** 10 min，试验组**前空气含菌量为 100 000 cfu/m3，**后为 50cfu/m3; 对照组处理前空气含菌量为 90 000 cfu/m3，处理后为 50 000 cfu/m3。该**剂作用 10 min 对空气中微生物的杀灭率按下法计算:
① **在空气中 10 min 的自然消亡率为：
② 对空气中微生物的杀灭率为:
该次试验，**剂作用 10min，可将空气中**杀灭 99.91%。
2.1.3.5 现场试验
(1) 根据使用时的实际情况，选择有代表性的房间并在室内无人情况下进行**效果观察。观察时，在**处理前用六级筛孔空气撞击式采样器进行空气中自然菌采样，作为**前样本(阳性对照)。**处理后，再作一次采样，作为**后的试验样本。
(2) 采样时，采样器置室内中央1.0m高处。房间大于10m2 者，每增加10m2 增设一个采样点。
(3)因现场试验环境条件变化较多，难以统一，无法测定准确的自然沉降率，故只按所得消亡率(自然衰亡和**处理中**的综合效果)做出验证结论。消亡率的计算按下式进行:
[举例:一无人手术室，**前采样，空气中的平均含菌量为 5000 cfu/m3。用某**剂喷雾对室内空气**30 min 后采样，含菌量减至 50cfu/m3。该**剂处理 30 min后，室内空气中自然菌的消亡率可按下法计算:
该**剂作用30min，可使房间内空气中自然菌的消亡率达99.00%。
(4)试验采样完成后，应将未用的同批培养基，与上述试验样本同时进行培养或接种后培养，作为阴性对照。阴性对照组若有菌生长，说明所用培养基有污染，试验无效，更换后重新进行。
(5) 试验重复 3次或以上。计算出每次的消亡率。除有特殊要求者外，对无人室内进行的空气**，每次的自然菌消亡率均≥90% 者为合格。
2.1.3.6 注意事项
(1)试验中，因控制统一的条件较难，故每次均需同时设置试验组与对照组。两组条件尽量保持一致。**前、后及不同次数间的环境条件亦应尽量保持一致。
(2) 注意记录试验过程中的温度和相对湿度，以便分析对比。
(3)所采样本应尽快进行微生物检验，以免影响结果的准确性。
(4) 每次试验完毕，气雾柜、气雾室应充分通风。必要时**冲洗，间隔4h后始可做**次试验。
(5)试验时，气雾柜(室)必须保持密闭，设有空气过滤装置，以防染菌空气外逸，污染环境。
(6)试验时，气雾柜、气雾室或现场房间应防止日光直射，以免造成**作用不稳定。
(7)气雾柜排风过滤装置中的滤材应定期更换，换下的滤材应经**后再作其他处理。
(8) 在气雾柜或密闭房间内进行**剂喷雾**时，用悬挂染菌样片法观察的**效果， 不能代表对空气的**效果。
2.1.4 水**效果鉴定试验
2.1.4.1 生活饮用水**效果鉴定
2.1.4.1.1 目的
检测生活饮用水**剂与**器械的**效果，以验证其对生活饮用水**能否达到卫生合格标准。
2.1.4.1.2 试验器材
(1) 大肠杆菌 (8099) 悬液。取 37℃ 培养 18h～24h 的新鲜大肠杆菌斜面，用生理盐水洗下菌苔，混匀后再用生理盐水适当稀释，配制成试验用大肠杆菌悬液。
(2) 微孔滤膜滤器和滤膜(滤膜孔径为 0.45μm～0.65μm，滤膜大小示滤器型号确定，目前常用有直径为 35 mm 和 47 mm 两种)。
(3) 抽滤水泵或气泵。
(4) 恒温水浴箱。
(5) 秒表。
(6) 三角烧瓶。
(7) 广口玻璃瓶 ( 500ml)。
(8) 无齿镊子。
(9) 品红亚硫酸钠培养基：见附录A。
(10) 中和剂(鉴定合格者，见 2.1.1.5 )。
(11) **定量杀灭试验用其他器材(见 2.1.1.7 )。
(12) 天然水样。
(13) 模拟现场**装置(见 2.1.4.1.8 )。
(14) 磁力搅拌器。
2.1.4.1.3 试验阶段
饮用水**效果的鉴定应经过实验室**试验，天然水样**试验两个阶段的检测。实验室试验的目的是以大肠杆菌为试验菌，用悬液定量**试验法测出在试管中**所需的剂量。天然水样**试验是由自然水体取样，进一步验证受试**剂或方法对成分较复杂的天然水的**效果。对用于较大水体(如人工游泳池水、高层建筑二次供水)**的设备和方法，必要时尚需进行模拟现场或现场试验，以进一步验证其**效果。
由于生活饮用水的卫生标准，除微生物外还需考虑化学污染等方面，因此对其**评价尚需由有关专业单位对其他条件，例如化学物质含量和 pH值等，进行检测和判定，以对所鉴定的**剂或器械做出合格与否的综合评价。
2.1.4.1.4 试验菌污染水样的配制
试验用试验菌污染水样用于试验室**试验。配制时，将用生理盐水配制的大肠杆菌悬液加入脱氯的自来水或蒸馏水中，使其含菌量达到 5´ 104 cfu/100ml～5 ´105 cfu/100ml。
2.1.4.1.5 试验菌污染水样中活菌的培养计数
(1) 将纤维滤膜在蒸馏水中煮沸** 3 次，每次15min。每次煮沸后需更换蒸馏水洗涤 2～3 次，以除去残留溶剂。
(2) 将滤器用压力蒸汽**( 121℃，20 min)，也可用酒精火焰**。
(3)用无菌镊子夹取无菌的滤膜边缘，将粗燥面向上，贴放在已**滤器的滤床上，稳妥地固定好滤器。取一定量待检水样(稀释或不稀释)注入滤器中，加盖，打开抽气阀门，在负压0.05Mpa 下抽滤。
(4) 水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。用无菌镊子夹取滤膜边缘，移放在品红亚硫酸钠琼脂培养基平板上，滤膜截留**面向上。滤膜应与琼脂培养基完全紧贴，当中不得留有气泡，然后将平板倒置，放入37℃ 恒温培养箱内培养 22h～24h。
(5) 观察结果和计数:计数滤膜上生长带有金属光泽的黑紫色大肠杆菌菌落，并计算出染菌水样中含有的大肠杆菌数 (cfu/100ml)。
2.1.4.1.6 实验室**试验操作程序
（1）饮水**剂**试验
1）试验分组
①试验组。申请**产品卫生许可批件时，按使用说明书规定的*短剂量，设定 1 个浓度，3个作用时间（使用说明书规定的*短作用时间，*短作用时间的1.5倍和*短作用时间的0.5倍），测定其对大肠杆菌的**效果。进行**产品监督检测时，按使用说明书规定的*短剂量，设定1 个浓度，1 个作用时间（使用说明书规定的*短作用时间），测定其对大肠杆菌的**效果。
② 阳性对照组，以未经**的试验菌污染水样进行活菌培养计数;
③ 阴性对照组，以试验所用同批次未经使用的培养基进行培养，观察有无**生长。
2）操作程序
①按 2.1.4.1.4所示方法配制试验菌污染水样。
②将装有试验菌污染水样的三角烧瓶放入恒温水浴箱(20℃±2℃)中，开动磁力搅拌器，使**在水中分布均匀。先取2份试验菌污染水样，按2.1.4.1.5所示方法进行大肠杆菌活菌计数(阳性对照组)。
③待水样的温度恒定后加入**剂，迅速搅拌均匀。从开始加**剂起计时，按规定时间吸取水样，注入装有中和剂的无菌三角烧瓶中，以终止**作用。
④将中和后水样，分别取 100 ml，10 ml，1 ml 各 2 份，按 2.1.4.1.5所示方法进行大肠杆菌的活菌培养计数。
⑤将未接种大肠杆菌的试验用同批培养基平板 2 个，置温箱中培养(阴性对照组)。
⑥试验重复3次。
3）结果评价
当阳性对照组平均菌量在 5 ´ 104 cfu/100 ml～5´ 105 cfu/100ml，阴性对照组均无菌生长时。在3次试验中均使大肠杆菌下降至 0/100 ml的*低剂量，可判定为实验室试验中饮水***低有效剂量。若阳性对照和阴性对照未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。
（2）饮水**器**试验
本节饮水**器械指能产生**液并用于饮水**的饮水**装置。
1）试验分组
①试验组。申请**产品卫生许可批件时，按使用说明书规定的*低剂量，设定 1 个作用浓度（使用说明书规定的*低作用浓度）和3个作用时间（使用说明书规定的*短作用时间，*短作用时间的1.5倍和*短作用时间的0.5倍），测定其对大肠杆菌的**效果。进行**产品监督检测时，按使用说明书规定的*低剂量，设定1 个浓度（使用说明书规定的*低作用浓度）和1 个作用时间（使用说明书规定的*短作用时间），测定其对大肠杆菌的**效果。
②阳性对照组，以未经**的试验菌污染水样进行活菌培养计数;
③阴性对照组，以试验所用同批次未经使用的培养基进行培养，观察有无**生长。
2）操作程序
①按 2.1.4.1.4 所示方法配制试验菌污染水样。
②取 2 份试验菌污染水样，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌活菌计数(阳性对照
组)。
③应用气压法或水泵法进行**处理。应用气压法时，按要求联接高压( 2kg/cm2～3 kg/cm2 )气源、耐压水样贮水器（3kg/cm2～5 kg/cm2）、流量计和饮水**器。应用水泵法时，则按要求联接耐压水样贮水器（3kg/cm2～5kg/cm2）、水泵、流量计和饮水**器。然后将加有试验菌的水样通过**器，将**过的水样放置至规定时间，再分别取其加于含中和剂的**三角瓶中，混匀。分别吸取中和后水样100ml，10ml，1ml 各 2 份，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌的活菌计数。
④将未接种大肠杆菌的试验用同批培养基平板 2个，置培养箱中培养(阴性对照组)。
⑤试验重复 3 次。
3）结果评价
当阳性对照组平均含菌量在5 ´ 104cfu/100ml～5´ 105cfu/100ml。阴性对照组均无菌生长时。在3次试验中使大肠杆菌均下降至0/100ml的*低剂量，可判定为实验室试验中饮水***低有效剂量。
若阳性对照组和阴性对照组含菌量未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。
（3）饮水过滤器**试验
1）试验分组
①试验组。申请**产品卫生许可批件时，按使用说明书规定的*大流量，测定其对大肠杆菌的**效果。
②阳性对照组，以未经**的试验菌污染水样进行活菌培养计数。
③阴性对照组，以试验所用同批次未经使用的培养基进行培养，观察有无**生长。
2）操作程序
①按 2.1.4.1.4 所示方法配制试验菌污染水样。
②取 2 份试验菌污染水样，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌活菌计数(阳性对照
组)。
③按使用说明书规定的*大流量，将试验菌污染水样(见 2.1.4.1.4)分段通过饮水过滤**装置。按规定过滤的水量，用无菌三角瓶分段采集:初始、1/4、2/4、3/4、4/4等各段流出的水样(不需加中和剂)。
④对过滤后各段水样，分别取 100ml、10ml、1ml各 2份，进行大肠杆菌活菌培养计数 (见 2.1.4.1.5 )。
⑤将未接种大肠杆菌的试验用同批培养基平板 2个，置培养箱中培养(阴性对照组)。
⑥试验重复 3 次。
3）结果评价
当阳性对照组平均含菌量在 5 ´ 104cfu/100ml～5´ 105 cfu/100ml。阴性对照组均无菌生长时。在 3次试验所有流量段水样中大肠杆菌下降至 0/100ml时，可判为实验室试验中饮水**效果合格。若阳性对照组和阴性对照组含菌量未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。
2.1.4.1.7**效果影响因素测定试验操作程序(用于饮用水化学**试验)
（1）水温影响试验:将人工染有大肠杆菌的水样，温度分别调控在5℃±2℃、20℃±2℃、30℃±2℃条件下，对不同温度的水样，按说明书上规定的*低使用剂量（1个浓度，1个作用时间）进行**试验，观察水温的影响。试验程序同2.1.4.1.5或2.1.4.1.6。试验重复3次。3次试验中，3个温度组**效果均达合格标准，判为温度对该**剂**效果影响不明显，所试剂量可在5℃～30℃条件下使用。否则应依据**效果确定仅可在**效果均达合格标准的温度区间内使用。试验中应设阳性对照和阴性对照组。两对照组结果未达要求见2.1.4.1.6（1）3），应寻找原因，纠正后重做试验。
（2）有机物影响试验
①腐殖酸配制：取 0.1g 腐殖酸（分析纯）用少许 2.0 mol/L 氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水 50 ml，用滤纸过滤至 100ml 容量瓶中，用 2.0 mol/L HCl 溶液调节 pH 值至中性，并定容至 100 ml，比色测定实际色度。
②水样制备：在水样中加入腐殖酸，比照标准色度管，使色度各为 0度、10度、15度，然后分别加入大肠杆菌悬液，配成不同色度的人工染有大肠杆菌水样。
③**处理：按说明书上推荐的*低使用剂量( 1 个浓度，1 个作用时间)进行**试验，观察有机物的影响。试验程序同2.1.4.1.6（1）或2.1.4.1.6（2）。试验重复 3 次。
④ 3 次试验中，3 个浓度的有机物组**效果均达合格标准，判为有机物对该**剂**效果影响不明显，所试剂量可用于色度低于 15度水的处理。否则应依据**效果确定仅可用于低于**效果均达合格标准色度水的处理。试验中应设阳性对照和阴性对照组。两对照组结果未达要求见2.1.4.1.6（1）3），应寻找原因，纠正后重做试验。
3）水中 pH 值的影响试验
①水样制备：用氢氧化钠（分析纯）或盐酸（分析纯）调水样 pH 值分别调为 6.5，7.0和 8.5，然后加入大肠杆菌悬液，配成不同pH 值的试验菌污染水样。
②**处理：按说明书上推荐的*低使用剂量(1 个浓度，1 个作用时间)进行**试验，观察 pH 值的影响。试验程序同2.1.4.1.6（1）或 2.2.1.4.1.6（2）。试验重复 3 次。
③ 3 次试验中，3 种 pH 值的**剂浓度**效果均达合格标准，判为 pH 值对该**剂**效果影响不明显，所试剂量可用于pH值6.5～8.5 水的处理。否则应依据**效果确定仅可在**效果均达合格标准的 pH值区间内使用。试验中应设阳性对照和阴性对照组。两对照组结果未达要求见2.1.4.1.6（1）3），应寻找原因，纠正后重做试验。
2.1.4.1.8 模拟现场试验和现场试验
考虑到实用情况下各种水质对**效果的影响，根据产品申报的使用范围，选用天然水样如井水、河水、湖水或高层建筑贮水箱的水等进行**试验。
（1）饮水**剂对天然水样**试验
1)根据说明书的*低使用剂量选择 1 个浓度，1 个作用时间，对天然水样进行**试验。同时设置阳性对照组与阴性对照组。
2)将装有天然水样的三角烧瓶放入恒温水浴箱(20℃±2℃ )中，开动磁力搅拌器，使**在水中分布均匀。取 2 份同批同类天然水样，每份 100ml，按2.1.4.1.5 所示方法计数大肠菌群数(阳性对照组)。
3)待水样的温度恒定后，加入**剂，迅速搅拌均匀。从开始加**剂起计时，按规定时间吸取水样，注入装有中和剂的无菌三角烧瓶中，以终止**作用。
4)将中和后水样，分别取 100ml 2 份，按 2.1.4.1.5所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。
5)将未接种水样的试验用同批培养基平板 2个，置培养箱中培养(阴性对照组)。
6)试验重复 3次。当阳性对照组均有菌生长。阴性对照组均无菌生长时，可判定在 3次试验中均使大肠菌菌群下降至 0/100ml，可判定为对天然水样**合格。
7)如阳性对照组含菌量未达上述要求和阴性对照组有菌生长，应寻找原因，纠正后重做试验。
（2）饮水**器对天然水样**试验
1)根据使用说明书的*低使用剂量选择 1 个浓度，1个作用时间，对天然水样进行**试验。
2)试验前，先取 2 份试验用天然水样，每份 100ml，按2.1.4.1.5 所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数(阳性对照组)。然后，将天然水样本按 2.1.4.1.6（2）2）要求通过**器进行**处理，将处理后水样移到含中和剂的三角烧瓶中，混匀。
3)将中和的水样 2 份，每份100ml，按 2.1.4.1.5所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。
4)大肠菌菌群的活菌培养计数量，按 2.1.4.1.5所示方法检测。用滤膜过滤法检测时，所用水量应一致，约数毫升。污染严重的天然水，检测时可适当稀释。
5)将未接种水样的试验用同批培养基平板 2个，置培养箱中培养(阴性对照组)。
6)试验重复 3次。当阳性对照组均有大肠菌群生长，阴性对照组均无菌生长时，在 3 次试验中均使大肠菌群下降至 0/100ml，可判定为对天然水样**合格。
7)如阳性对照组含菌量未达上述要求和阴性对照组有菌生长，应寻找原因，纠正后重做试验。
（3）饮水过滤器对天然水样的**试验
1)取 2 份试验用天然水样，每份 100ml，按 2.1.4.1.5所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。所得结果作为过滤前含菌量(阳性对照组)。
2)按过滤器产品规定流量，将天然水样分段通过过滤器。按规定过滤的水量，用无菌三角瓶分段采集:初始、1/4、2/4、3/4、4/4等各段流出的水(不需加中和剂)。
3)对过滤后各段水样，分别取 100ml、10ml、1ml 各 2份，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。
4)将未接种水样的试验用同批培养基平板 2个，置培养箱中培养(阴性对照组)。
5)试验重复 3 次。当阳性对照组均有菌生长，阴性对照组均无菌生长，3次试验中所有流量段水样大肠菌群均降至 0/100ml，可判为对天然水样的**效果合格。
6)如阳性对照组和阴性对照组含菌量未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。
（4）高层建筑二次供水**设备和方法
对较大水体**设备和方法的鉴定，在模拟现场和现场试验中选做其一即可，但首先应考虑后者，只有在无法进行现场试验时，才做模拟现场试验。大水体现场**试验的操作程序，随当时当地情况，设备大小和所采取的**方法而定。
1)高层建筑二次供水**有两种主要方式，一是直接对贮水池中的水用物理或化学法**，一是将贮水池水引出通过**装置(如紫外线照射装置、过滤装置或**剂添加和搅拌装置等)进行**，遂后再输送到用户。
2)直接对水池中水进行**的设备和方法的鉴定，可参照游泳池水**设备和方法鉴定的有关要求进行**和采样检测(见2.1.4.2 )。试验剂量选用使用说明书中规定者，样本按 2.1.4.1.5所示方法进行活菌培养计数。检测中阴性对照组的设置和结果的评价，与天然水样**试验相同[见2.1.4.1.8（1）；2.1.4.1.8（2）；2.1.4.1.8（3）]。但检测需重复5次，结果均符合要求者(使用含氯**剂**的水样，剩余氯量为0.3 mg/L～0.5mg/L )可判为合格。
3)将水引出后**的设备和方法的鉴定，可在进入**器和**后出水口管道上各加一三通阀门，分别采集**前和**后水样。将样本按 2.1.4.1.5所示方法进行活菌培养计数。试验剂量选用使用说明书规定者。检测中阴性对照组的设置和结果的评价，与天然水样**试验相同[见2.1.4.1.8（1）；2.1.4.1.8（2）；2.1.4.1.8（3）]。但检测需重复 5次，结果均符合要求者(使用含氯**剂**的水样，剩余氯量为 0.3 mg/L～0.5 mg/L )可判为合格。
4)对条件不容许加装三通阀门时，可进行模拟现场试验。先设一大型水箱(大小根据鉴定的**设备流量和试验时间计算)，在其出水口下游用管道依次连接水箱出口阀门、排水泵、三通阀门(一端接下面的流量计，另一端接一回流管，必备需要时可将菌悬液送回水箱)、流量计和所鉴定的**装置。**装置的进水口前装一三通阀门，以备采集阳性对照水样。
试验时，水箱内盛装含大肠杆菌悬液(大肠杆菌浓度在5´104cfu/100ml～5´105cfu/100ml，见 2.1.4.1.4)的水样。打开水箱出口阀门，根据流量计所示，用阀门和水泵控制流出水样的量和压力，并使按规定流量进入**装置。当水流按规定流量稳定地由**装置出水口流出后，先采阳性对照水样，而后由**装置出水口采集**后水样。将水样按2.5.5 所示方法进行活菌培养计数。试验剂量选用使用说明书规定者。检测中，阴性对照组的设置和结果的评价，与天然水样**试验相同[见2.1.4.1.8（1）；2.1.4.1.8（2）；2.1.4.1.8（3）]。但检测需重复 5次，结果均符合要求者(使用含氯**剂**的水样，剩余氯量为 0.3 mg/L～0.5 mg/L )可判为合格。
其他类似设备和方法亦可参照有关原则进行。
2.1.4.2人工游泳池水**效果鉴定
(1) 水样采集。游泳池水面≤1000 m2，设2 个采样点，超过 1000m2 的，设3 个采样点。
(2)鉴定时应在暑季游泳人员处于高峰期时进行。室内游泳池可根据情况在其他季节进行，但亦应在游泳人员的高峰期。
(3) 采样时，使用无菌玻璃瓶在水面下 30 cm深处采集。再将水样加入有适量鉴定合格的中和剂溶液(见 2.1.1.2.5 )的无菌玻璃瓶中。每点采 1 个样本。每日采 2次，一次在清晨**前(作为阳性对照)，一次在**后当日游泳人员高峰时，作为**后样本。
(4)试验剂量选用说明书规定者。对样本，应检测**总数和大肠菌群数。使用含氯**剂时，还应测定水中的剩余氯含量。检测方法按《公共场所卫生标准监测检验方法》中的规定进行。
(5)**后样本检测结果，**总数应≤1000cfu/ml，大肠菌群≤18cfu/L (见游泳场所卫生标准))。
(6) 检测按日重复 5 次。5次全部符合上述要求者可判为合格。
2.1.4.3 注意事项
（1）在**前，对饮水**器与饮水过滤器，应用无菌水冲洗和通过5min～10min，以消除内表面污垢并证明管路通畅。
（2）水处理中，极易遭污染，故试验材料、采样口和操作应严格保持无菌要求，否则可造成较大误差。
（3）模拟试验所用多余的菌悬液、水样等，应**后方可排放。所用设备与物品亦须进行彻底**后再进行下一次试验。
