离子色谱分析方法的开发步骤

分析者对待测离子应有一些一般信息，首先应了解待测化合物的分子结构和性质以及样品的基体情况，如无机还是有机离子，离子的电荷数，是酸还是碱，亲水还是疏水，是否为表面活性化合物等。待测离子的疏水性和水合能是决定选用何种分离方式的主要因素。水合能高和疏水性弱的离子，如Cl^-或K⁺，*好用HPIC分离。水合能低和疏水性强的离子，如高氯酸（ClO₄^-）或四丁基铵，*好用亲水性强的离子交换分离柱或MPIC分离。有一定疏水性也有明显水合能的pKa值在1与7之间的离子，如乙酸盐或丙酸盐，*好用HPICE分离。有些离子，既可用阴离子交换分离，也可用阳离子交换分离，如氨基酸，生物碱和过渡金属等。

很多离子可用多种检测方式。例如测定过渡金属时，可用单柱法直接用电导或脉冲安培检测器，也可用柱后衍生反应，使金属离子与PAR或其它显色剂作用，再用UV/VIS检测。一般的规律是：对无紫外或可见吸收以及强离解的酸和碱，*好用电导检测器；具有电化学活性和弱离解的离子，*好用安培检测器；对离子本身或通过柱后反应后生成的络合物在紫外可见有吸收或能产生荧光的离子和化合物，*好用UV/VIS或荧光检测器。若对所要解决的问题有几种方案可选择，分析方案的确定主要由基体的类型、选择性、过程的复杂程度以及是否经济来决定。表5-3和表5-4总结了对各种类型离子可选用的分离方式和检测方式。                                              

离子色谱柱填料的发展推动了离子色谱应用的快速发展，对多种离子分析方法的开发提供了多种可能性。特别应提出的是在pH0-14的水溶液和100%有机溶剂（反相高效液相色谱用有机溶剂）中稳定的亲水性高效高容量柱填料的商品化，使得离子交换分离的应用范围更加扩大。常见的在水溶液中以离子形态存在的离子，包括无机和有机离子，以弱酸的盐（Na₂CO₃/NaHCO₃,KOH、NaOH）或强酸（H₂SO₄、甲基磺酸、HNO₃、HCl）为流动相，阴离子交换或阳离子交换分离，电导检测，已是成熟的方法，有成熟的色谱条件可参照。对近中性的水可溶的有机“大”分子（相对常见的小分子而言），若待测化合物为弱酸，则由于弱酸在强碱性溶液中会以阴离子形态存在，因此选用较强的碱为流动相，阴离子交换分离；若待测化合物为弱碱，则由于在强酸性溶液中会以阳离子形态存在，选用较强的酸作流动相，阳离子交换分离；若待测离子的疏水性较强，由于与固定相之间的吸附作用而使保留时间较长或峰拖尾，则可在流动相中加入适量有机溶剂，减弱吸附，缩短保留时间、改善峰形和选择性。对该类化合物的分离也可选用离子对色谱分离，但流动相中一般含有较复杂的离子对试剂。此外，对弱保留离子可选用高容量柱和弱淋洗液以增强保留，对强保留离子则反之。表5-3、表5-4列出了离子色谱中常用的两种主要检测器:电化学检测器（包括电导和安培）和光学检测器。在水溶液中以离子形态存在的离子，即较强的酸或碱，应选用电导检测器。具有对紫外或可见光有吸收基团或经柱后衍生反应后（IC中较少用柱前衍生）生成有吸光基团的化合物，选用光学检测器。具有在外加电压下可发生氧化或还原反应基团的化合物，可选用直流安培或脉冲安培检测。对一些复杂样品，为了一次进样得到较多的信息，可将两种或三种检测器串联使用。

（1）稀释样品

对组成复杂的样品，若待测离子对树脂亲合力相差颇大，就要作几次进样，并用不同浓度或强度的淋洗液或梯度淋洗。若待测离子之间的浓度相差较大，而且对固定相亲合力差异较大，增加分离度的*简单方法是稀释样品或做样品前处理。例如盐水中SO₄^2-和Cl^－的分离。若直接进样，在常用的分析阴离子的色谱条件下，其色谱峰很宽而且拖尾，30min之后Cl^－的洗脱仍在继续，表明进样量已超过分离柱容量。在这种情况下，在未恢复稳定基线之前不能再进样。若将样品稀释10倍之后再进样就可得到Cl^－与痕量SO₄^2-之间的较好分离。对阴离子分析推荐的*大进样量，一般为静态柱容量的30%，超过这个范围就会出现大的平头峰或肩峰。

 

表5-3分离方式和检测器的选择（阴离子）

 

表5-4分离方式和检测器的选择（阳离子）

 

（2）改变分离和检测方式

若待测离子对固定相亲合力相近或相同，样品稀释的效果常不令人满意。对这种情况，除了选择适当的流动相之外，还应考虑选择适当的分离方式和检测方式。例如，NO₃^-和ClO₃^-，由于它们的电荷数和离子半径相似，在阴离子交换分离柱上共淋洗。但ClO₃^-的疏水性大于NO₃^-，在离子对色谱柱上就很容易分开了。又如NO₂^-与Cl^－在阴离子交换分离柱上的保留时间相近，常见样品中Cl^－的浓度又远大于NO₂^-，使分离更加困难，但NO₂^-有强的UV吸收，而Cl^－则很弱，因此应改用紫外作检测器测定NO₂^-，用电导检测Cl^－，或将两种检测器串联，于一次进样同时检测Cl^－与NO₂^-。对高浓度强酸中有机酸的分析，若采用离子排斥，由于强酸不被保留，在死体积排除，将不干扰有机酸的分离。

（3）样品前处理

对高浓度基体中痕量离子的测定，例如海水中阴离子的测定，*好的方法是对样品作适当的前处理。除去过量Cl^－的前处理方法有：使样品通过Ag⁺型前处理柱除去Cl^－，或进样前加AgNO₃到样品中沉淀Cl^－；也可用阀切换技术，其方法是使样品中弱保留的组分和90%以上的Cl^－进入废液，只让10%左右的Cl^－和保留时间大于Cl^－的组分进入分离柱进行分离。

（4）选择适当的淋洗液

离子色谱分离是基于淋洗离子和样品离子之间对树脂有效交换容量的竞争，为了得到有效的竞争，样品离子和淋洗离子应有相近的亲合力。下面举例说明选择淋洗液的一般原则。用CO₃^2-/HCO₃^-作淋洗液时，在Cl^－之前洗脱的离子是弱保留离子，包括一价无机阴离子、短碳链一元羧酸和一些弱离解的组分，如F^－、HCOO^－、CH₃COO^－、AsO₂^-、CN^－和S^2-等。对HCOO^－、CH3COO^－、与F^－、Cl^－等的分离应选用较弱的淋洗离子，常用的弱淋洗离子有HCO₃^-、OH^－和B₄O₇^2-。由于HCO₃^-和OH^－易吸收空气中CO₂，CO₂在碱性溶液中会转变成CO₃^2-，CO₃^2-的淋洗强度较HCO₃^-和OH^－大，因而不利于上述弱保留离子的分离。B₄O₇^2-亦为弱淋洗离子，但溶液稳定，是分离弱保留离子的推荐淋洗液。中等强度的碳酸盐淋洗液对高亲和力组分的洗脱效率低。对离子交换树脂亲合力强的离子有两种情况，一种是离子的电荷数大，如PO₄^3-、AsO₄^3-和多聚磷酸盐等；一种是离子半径较大，疏水性强，如I^－、SCN^-、S₂O₃^2-，苯甲酸和柠檬酸等。对前者以增加淋洗液的浓度或选择强的淋洗离子为主。对后一种情况，推荐的方法是在淋洗液中加入有机改进剂(如甲醇、乙腈和对氰酚等)或选用亲水性的柱子，有机改进剂的作用主要是减少样品离子与离子交换树脂之间的非离子交换作用，占据树脂的疏水性位置，减少疏水性离子在树脂上的吸附，从而缩短保留时间，减少峰的拖尾，并增加测定灵敏度。

在离子色谱中，可由加入不同的淋洗液添加剂来改善选择性，这种淋洗液添加剂只影响树脂和所测离子之间的相互作用，而不影响离子交换。对与树脂亲合力较强的离子，如一些可极化的离子，I^－和ClO₄^-，以及疏水性的离子，苯甲酸和三乙胺等，在淋洗液中加入适量极性的有机溶剂如甲醇或乙腈，可缩短这些组分的保留时间并改善峰形的不对称性。为了减少样品离子与树脂之间的非离子交换作用，减少树脂对疏水性离子的吸附，在阴离子分析中，可在淋洗液中加入对氰酚。如测定1%NaCl中的痕量I^－和SCN^－时，加入对氰酚占据树脂对I^－和SCN^－的吸附位置，从而减少峰的拖尾并增加测定的灵敏度。IC中，一价淋洗离子洗脱一价待测离子，二价淋洗离子洗脱二价待测离子，淋洗液浓度的改变对二价和多价待测离子保留时间的影响大于一价待测离子。若多价离子的保留时间太长，增加淋洗液的浓度是较好的方法。

2.2 减少保留时间

缩短分析时间与提高分离度的要求有时是相矛盾的。在能得到较好的分离结果的前提下分析的时间自然是越短越好。为了缩短分析时间，可改变分离柱容量、淋洗液流速、淋洗液强度，在淋洗液中加入有机改进剂和用梯度淋洗技术。

以上方法中*简便的是减小分离柱的容量，或用短柱。例如用3×500mm分离柱分离NO₃^-和SO₄^2-，需用18min，而用3×250mm的分离柱，用相同浓度的淋洗液只用9min。但NO₃^-和SO₄^2-的分离不好，若改用稍弱的淋洗液就可得到较好的分离。

大的进样体积有利于提高检测灵敏度，但导致大的系统死体积，即大的水负峰，因而推迟样品离子的出峰时间。如在Dionex的AS11柱上用NaOH为淋洗液，进样量分别为25μL、250μL和750μL时，F^－的保留时间分别为2.0min、2.5min和3.6min。为了减小保留时间，*好用小的进样体积。

增加淋洗液的流速可缩短分析时间，但流速的增加受系统所能承受的*高压力的限制，流速的改变对分离机理不完全是离子交换的组分的分离度的影响较大，例如对Br^－和NO₂^-之间的分离，当流速增加时分离度降低很多，而分离机理主要是离子交换的NO₃^-和SO₄^2-，甚至在很高的流速时，他们之间的分离度仍很好。

增加淋洗液的强度对分离度影响与缩短分离柱或增加淋洗液的流速相同。用较强的淋洗离子可加速离子的淋洗，但对弱保留和中等保留的离子，会降低分离度。当用弱淋洗液（如B₄O₇^2-）分离弱保留样品离子时，弱保留离子，如奎尼酸盐、F^－、乳酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲酸盐、丁酸盐、甲基磺酸盐、丙酮酸盐、戊酸盐、一氯醋酸盐、BrO₃^-和Cl^－等得到较好分离。但一般样品中都含有一些对阴离子交换树脂亲合力强的离子，如SO₄^2-、PO₄^3-、草酸盐等，如果用等浓度淋洗，它们将在一小时之后甚至更长时间才被洗脱。对这种情况，应于3-5次进样之后，用高浓度的强淋洗液作样品进一次样，将强保留组分从柱中推出来，或者用较强的淋洗液洗柱子半小时。在淋洗液中加入有机改进剂，可缩短保留时间和减小峰的拖尾。

2.3 改善检测灵敏度

首先是按说明书操作，是仪器在*佳工作状态，得到稳定的基线，才可将检测器的灵敏度设置在较高灵敏档，这是提高检测灵敏度的*简单方法，但此时基线噪音也随之增大。

**种方法是增加进样量。直接进样，进样量的上限取决于保留时间*短的色谱峰与死体积（IC中一般称水负峰）之间的时间，例如用IonPacCS12A柱，12mmol/L硫酸作淋洗液。进样体积1300μL，可直接用电导检测低μg/L的碱金属和碱土金属，见图5-11。图中，Li⁺（保留时间*小的峰）的保留时间为4.1min，水负峰在1.6min，Li⁺峰与水负峰之间相隔达2.5min，因此可直接用大体积进样。而在阴离子分析中，若用CO₃^2-/HCO₃^-作流动相，由于F^－峰（保留时间*短的峰）靠近水负峰，若增加进样体积，水负峰增大，F^－的峰甚至与水负峰分不开；另一方面由于F^－的保留时间一般小于2min，若进样量大于1ml，流速为1mL/min-2mL/min，F^－没有足够的时间参加色谱过程，因此峰拖尾定量困难。若用亲水性强的固定相，以NaOH为淋洗液，特别是梯度淋洗时，由于梯度淋洗开始时NaOH浓度低，又由于通过抑制器之后的背景溶液是低电导的水，几乎无水负峰，这种情况可适当增大进样量，图5-12表明，若进样量为1000μL可直接测定0.1μg/L的常见阴离子。

第三种方法是用浓缩柱，但一般只用于较清洁的样品中痕量成分的测定，用浓缩柱时要注意，不要使分离柱超负荷。柱子的动态离子交换容量小于理论值的30%。用浓缩柱富集F^－时，若样品中同时还含有保留较强的离子，如SO₄^2－或PO₄^3-等，F^－的回收不好。其原因是样品中的SO₄^2－或PO₄^3-也起淋洗离子的作用，可将弱保留的F^－部分洗脱下来。对弱保留的离子，若浓缩柱的柱容量不是足够大，则用加大进样量方法所得到的结果较用浓缩柱好。

第四种方法是用微孔柱。离子色谱中常用的标准柱的直径为4mm，微孔柱的直径为2mm。因为微孔柱较标准柱的体积小4倍，在微孔柱中进同样（与标准柱）质量的样品，将在检测器产生4倍于标准柱的信号。从动力学的角度考虑，在相同的流动线速度下，内径较大的柱子比内径较小的柱子有较大的洗脱体积，故样品在内径较大的柱子内被稀释的程度较内径较小的柱子严重，另外，内径较小的柱子在进行离子交换时更易洗脱，同时死体积较小，因此即使进样量较大也不会出现色谱峰严重拖尾的现象，同时可以避免使用浓缩柱时可能会出现的由于过高的基体造成某些待测离子不能定量保留的现象。而且淋洗液的用量只为标准柱的四分之一，因而减少淋洗液的消耗。