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**产品毒理学实验技术规范
日期：2025-05-02 11:06
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摘要：
2.3.1急性经口毒性试验
2.3.1.1 目的
（1)检测**剂对实验动物的急性毒性作用和强度。
（2)为亚急（慢）性毒性等试验提供剂量选择的依据。
2.3.1.2 实验动物
小鼠或大鼠任选一种，雌雄各半。小鼠体重18g～22g，大鼠体重180g～220g，根据不同的计算LD50方法，选用适当的动物数量。
2.3.1.3 试验分组
如应用概率单位-对数图解法计算LD50，随机分为5个～6个剂量组。通常*高剂量组的动物死亡率应≥90%，*低剂量组动物死亡率应≤10%。可先以较大的组距较少量动物进行预试，找出其粗略致死剂量范围，然后再设计正式试验的剂量分组。
2.3.1.4 操作程序
（1）动物的准备：试验前，一般禁食过夜，不限制饮水。
（2）受试物的配制：常以水或食用植物油为溶剂配制成溶液，或采用0.5%羧甲基纤维素配制成混悬液。灌胃给予受试物的*大容量，小鼠不超过0.2ml/10g体重，大鼠不超过1.0ml/100g体重。
（3）染毒方法：用灌胃方式将受试物一次给予动物。若受试物毒性很低，一次灌胃容量太大，可在24h内分成2次～3次给予，其总剂量作为一日剂量计算。
（4）染毒后观察动物的中毒表现和死亡数及死亡时间，并对死亡动物和观察期满处死动物进行尸体解剖，肉眼观察，发现有异常的组织或脏器，尚需进一步作组织病理学检查。观察时间14d。
2.3.1.5LD50的计算方法
根据给受试物后14d内的各剂量组动物死亡率计算LD50半数致死剂量)。 (
2.3.1.5.1概率单位-对数图解法：
（1）根据各剂量组动物死亡率，从表2-9 中查各组的概率单位。因死亡率为 0% 和100%的概率单位，与所试动物数有关，故需另在表2-10中查找。
例如：对死亡率为45%的概率单位，可查表2-9。先在表的左侧纵标目上找到40，而后在表的上行横标目处找到5，两者交叉点处的4.87，即为45% 的概率单位。
又如:某组用 10只实验动物，如果全部存活(死亡率为0%)，查表2-10，其概率单位为 3.04。
表2-9 百分率-概率单位换算表
% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 .. 2.67 2.95 3.12 3.25 3.36 3.45 3.52 3.59 3.66
10 3.72 3.77 3.82 3.87 3.92 3.96 4.01 4.05 4.08 4.12
20 4.16 4.19 4.23 4.26 4.29 4.33 4.36 4.39 4.42 4.45
30 4.48 4.50 4.53 4.56 4.59 4.61 4.64 4.67 4.69 4.72
40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97
50 5.00 5.03 5.05 5.08 5.10 5.13 5.15 5.18 5.20 5.23
60 5.25 2.28 5.31 5.33 5.36 5.39 5.41 5.44 5.47 5.50
70 5.52 5.55 5.58 5.61 5.64 5.67 5.71 5.74 5.77 5.81
80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6.08 6.13 6.18 6.23
90 6.28 6.34 6.41 6.48 6.55 6.64 6.75 6.88 7.05 7.33
注: 横标目数字为死亡率的个位数，纵标目数字为死亡率的十位数。
表2-10 相应于反应率为 0％及100％的概率单位
该组动物数 反应率 该组动物数 反应率
0% 100% 0% 100%
... ... ... 11 3.00 7.00
2 3.85 6.15 12 2.97 7.03
3 3.62 6.38 13 2.93 7.07
4 3.47 6.53 14 2.90 7.10
5 3.36 6.64 15 2.87 7.13
6 3.27 6.73 16 2.85 7.15
7 3.20 6.80 17 2.82 7.18
8 3.13 6.87 18 2.80 7.20
9 3.09 6.91 19 2.78 7.22
10 3.04 6.96 20 2.76 7.24
（2)用方格纸绘散点图，横轴表示剂量的对数值(X)，纵轴为概率单位值(Y)，将各组数值点在图上。
（3)按各点的分布趋势，用直尺绘出一条*适合于各点的直线，使线上方的点到线的总距离与线下方的点到线的总距离相近，此线应尽量靠近概率单位为 5的点及附近的点。
（4） 查出求概率单位 5 处的剂量对数，其反对数即为LD50。
按下列公式计算 LD50的 95%可信限。
S =(X2 －X1－Y1))/(Y2
Sm=S/(N'/2)-1/2
LD50对数值的95%可信限 = logLD50 ±1.96Sm
(上式结果，经反对数变换后，可得LD50的95%可信限)
[Sm为 LD50的标准误；S为标准差；X1、X2分别为机率单位等于4(Y1和6(Y2时相应的剂量对数值；N'为Y1及Y2相应的死亡率间所用的动物数]。(=6)(=4)))
2.3.1.5.2一次*大限度试验：
如20只动物(雌雄各半)一次灌胃剂量5000mg/kg体重，在14d内又无死亡，可判定LD50大于5000mg/kg体重。
2.3.1.5.3其他方法：如霍恩(Horn)法、寇氏(Karber)法等。
2.3.1.6 评价规定
**剂的毒性评价：
LD50大于5000mg/kg体重者属实际无毒；
LD50为501mg/kg～5000mg/kg体重者属低毒；
LD50为51mg/kg～500mg/kg体重者属中等毒；
LD50为1mg/kg～50mg/kg体重者属高毒；
LD50小于1mg/kg体重者属剧毒。
注：为评价**剂在实际应用时对人体的**性，当产品原形LD50≤5000mg/kg体重时，需增做**剂*高应用液浓度5倍溶液的急性经口毒性试验，并计算其LD50。
2.3.2急性吸入毒性试验
2.3.2.1 目的
检测**剂对实验动物的急性吸入毒性作用和强度。
2.3.2.2实验动物
小鼠或大鼠任选一种，雌雄各半。小鼠体重为18g～22g，大鼠体重为180g～200g。
2.3.2.3 操作程序
染毒可采用静式染毒法或动式染毒法。
2.3.2.3.1 静式染毒法
静式染毒是将实验动物放在一定体积的密闭容器（染毒柜）内，加入一定量的**剂，并使其挥发，造成实验需要**剂浓度的空气，一次吸入性染毒2h。
（1）染毒柜的容积以每只染毒小鼠每小时不少于3L空气计，每只大鼠不少于30L计。
（2）染毒浓度的计算：染毒浓度一般应采用实际测定浓度。在染毒期间一般可测4次~5次，求其平均浓度。在无适当测试方法时。可用下式计算染毒浓度
a×d
C= ×106
V
式中: C— 染毒浓度（mg/m3）
a— 加入**剂量(ml)
d— **剂比重
V— 染毒柜容积（L）
2.3.2.3.2 动式染毒法
动式染毒是采用机械通风装置，连续不断地将含有一定浓度**剂的空气均匀不断地送入染毒柜，并排出等量的染毒气体，维持相对稳定的染毒浓度。一次吸入性染毒2h。
（1）**剂气化（雾化）和输入的常用方法
1） 气体**剂，经流量计与空气混合成一定浓度后，直接输入染毒柜。
2） 易挥发液体**剂，通过空气鼓泡或适当加热促使挥发后输入染毒柜。
3） 若**剂现场使用采取喷雾法时，可采用喷雾器或超声雾化器使其雾化后输入染毒柜。
（2）染毒浓度计算 染毒浓度一般应采用动物呼吸带实际测定浓度，每半小时一次，取其平均值。若无适当的测试方法，也可采用以下公式计算染毒浓度：
a×d
C= ×106
V1+ V2
式中： C— 染毒浓度（mg/m3）
a— 气化或雾化**剂量(ml)
d— **剂比重
V1— 输入染毒柜风量(L)
V2— 染毒柜容积（L）
2.3.2.3.3观察和记录染毒过程和观察期内的动物症状和死亡情况。关于染毒浓度的设计、动物分组、观察期限、观察指标和LC50（半数致死浓度）的计算等可参照急性经口毒性试验(2.3.1)。
在预试验的基础上，如20只动物（雌雄各半）一次2h吸入染毒浓度10000mg/m3，在14d内无死亡，可判定LC50大于10000mg/m3。
2.3.2.4评价规定
**剂的毒性评价：
LC50 2h大于10000mg/m3 者属实际无毒；
LC50 2h为1001mg/m3～10000mg/m3 者属低毒；
LC50 2h为101mg/m3～1000mg/m3 者属中等毒；
LC50 2h为10mg/m3～100mg/m3 者属高毒；
LC50小于10mg/m3者属剧毒。 2h
2.3.3 皮肤刺激试验
2.3.3.1 目的
检测**剂对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度。
2.3.3.2 实验动物
每次试验至少需 3 只皮肤完好的健康家兔或豚鼠。
2.3.3.3 操作程序
2.3.3.3.1一次完整皮肤刺激试验
(1)在试验前24h，用脱毛剂将家兔或豚鼠背部脊柱两侧的毛去掉，不得损伤皮肤。去毛范围，左、右各约3cm×3cm。
(2)次日将受试物(浓度一般为皮肤**应用液的5倍或原液0.5ml（g）直接滴于面积为2.5cm×2.5cm的一侧去毛完整皮肤上，或滴于同样大小的2层~4层纱布上并敷贴在一侧去毛皮肤表面，然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激胶布固定。另一侧去毛皮肤作为空白对照(或溶剂对照)。敷贴时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。
(3)分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应，并按表2-11进行刺激反应评分。
2.3.3.3.2 一次破损皮肤刺激试验
（1）涂受试物前，在2.5cm×2.5cm的去毛皮肤上，用75％酒精清洁、**暴露皮
肤，待酒精挥发后，用**刀片或注射针头在皮区内划一个“井”形的破损伤口，并在该破损皮区内染毒。注意皮肤破损仅达表皮，不要伤及真皮。
（2）手术前的皮肤准备，手术后受试物涂抹和局部皮肤反应的观察，评分方法同
2.3.3.3.1。注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别，若有感染可疑，应进行重复测试。
2.3.3.3.3多次完整皮肤刺激试验
（1）试验前动物皮肤准备同2.3.3.3.1 （1）。
（2）次日将受试物[浓度同2.3.3.3.1(2)]0.5ml（g）涂在一侧皮肤上，另一侧涂溶剂作为对照，在涂抹后4h，用水或无刺激的适宜溶剂清洗，除去残留物。每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察结果，按表2-11评分。为了便于受试物的涂抹和结果观察，必要时应剪毛。对照区的处理方法同试验区。
2.3.3.4 评价规定
2.3.3.4.1一次皮肤刺激试验
在各个观察时间点，按照表2-11对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分，并分别按时间点将3只动物的评分相加，除以动物数，获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均值(刺激指数)。取其中*高皮肤刺激指数，按表2-12评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别。
2.3.3.4.2多次皮肤刺激试验
按下列公式计算每天每只动物平均积分（刺激指数），并以表2-12判定皮肤刺激强度。
∑（每只动物14d的红斑和水肿总积分）
每天每只动物平均积分=
受试动物数×14
表2-11 皮肤刺激反应的评分标准
皮肤刺激反应 皮肤刺激反应评分
红斑形成：
无 0
勉强可见 1
明显 2
严重 3
紫红色红斑，并有焦痂 4
水肿形成:
无 0
勉强可见 1
皮肤隆起，轮廓清楚 2
水肿隆起约1mm 3
水肿隆起超过1mm 4
表2-12 皮肤刺激强度分级
皮肤刺激指数 刺激强度级别
0～＜0.5 无刺激性
0.5～＜2.0 轻刺激性
2.0～＜6.0 中等刺激性
6.0～8.0 强刺激性
2.3.4急性眼刺激试验
2.3.4.1 目的
检测**剂对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用。
2.3.4.2 实验动物
使用3只家兔。试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。
2.3.4.3 操作程序
（1）受试物一般为黏膜**或空气**应用液的5倍浓度的溶液或原液。吸取受试物0.1ml，滴入家兔一侧眼结膜囊内。另一侧眼以生理盐水作为正常对照。
（2）滴受试物后，将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如果72h内未出现刺激反应，或第7d或第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。必要时，用2% 荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。
2.3.4.4 评价规定
按表2-13对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在三个不同观察时间（24h、48h和72h）角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”（即每只动物的24h、48h和72h评分之和除以观察数3）。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间进行，按表2-14、表2-15眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。
表2-13 家兔急性眼刺激反应的评分标准
眼损害表现 评 分
角膜损害：
无溃疡形成或混浊 0
散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清 2
出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见 3
角膜不透明，混浊，虹膜无法辨认 4
虹膜损害：
正常 0
皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围有中度充血，
瞳孔对光仍有反应 1
出血、肉眼可见破坏，或瞳孔对光无反应 2
结膜（睑结膜、球结膜）充血
血管正常 0
血管充血呈鲜红色 1
血管充血呈深红色，血管不易分辨 2
弥漫性充血呈紫红色 3
结膜（睑结膜、球结膜）水肿
无水肿 0
轻微水肿(包括瞬膜) 1
明显水肿，伴有部分眼睑外翻 2
水肿至眼睑近半闭合 3
水肿至眼睑大半闭合 4
表2-14 眼刺激性反应分级标准
可 逆 性 损 伤 | 无刺激性 | 3只动物的平均评分：角膜损害＜1、虹膜损害＜1、结膜充血＜2和结膜水肿＜2或3只动物中至少有2只动物的平均评分符合上述标准。另外1只动物的刺激反应在21d内完全恢复。 |
轻刺激性 | 3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥1；虹膜损害≥1；结膜充血≥2；结膜水肿≥2，且7d内全部动物的刺激反应完全恢复。 | |
刺激性** | 3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥1；虹膜损害≥1；结膜充血≥2；结膜水肿≥2，且21d内全部动物的刺激反应完全恢复。 | |
不可逆性损伤 | 腐蚀性*** | 至少有1只动物的角膜、虹膜或结膜的刺激反应在21d的观察期内未完全恢复或/和在3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥3；虹膜损害≥1.5。 |
注：完全恢复是指动物的眼刺激反应评分：角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，
结膜水肿=0或1。
** 刺激性：接触受试物后所产生的可逆性炎性反应。
*** 腐蚀性：接触受试物后所产生的不可逆性组织损伤。
表2-15 眼刺激性反应分级标准
平均评分 | 动物数（只） | 恢复时间（d）* | 损伤类型 |
角膜损害＜1和 虹膜损害＜1和 结膜充血＜2和 结膜水肿＜2 | ≥2 | ≤21 | 无刺激性 |
角膜损害≥1或 虹膜损害≥1或 结膜充血≥2或 结膜水肿≥2 | ≥2 | ≤7 | 轻刺激性 |
≤21 | 刺激性 | ||
角膜损害≥3或 虹膜损害≥1.5 | ≥2 | 腐蚀性** | |
角膜损害≥1或 虹膜损害≥1或 结膜充血≥1或 结膜水肿≥1 | ≥1 | ＞21 |
*:恢复时间:为动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1
的时间。
**：腐蚀性：至少有1只动物于21d尚存在角膜粘连或血管翳，也可判为腐蚀性。
2.3.5**黏膜刺激试验
2.3.5.1目的
检测**剂对实验动物**黏膜的刺激作用和强度。
2.3.5.2实验动物
选用健康、初成年的雌性白色家兔，同一品系，体重2.0kg~2.5kg。试验前应检查动物**口有无分泌物、充血、水肿和其它损伤情况。如有炎症或（和）损伤，应弃用。*好选择动物的非动情期做试验。
2.3.5.3试验分组
分为染毒组和对照组，每组3只。
表2-16 **黏膜刺激反应评分标准
**组织反应 | 反应评分 |
A．上皮组织 | |
正常，完好无损 | 0 |
细胞变性或变扁平 | 1 |
组织变形 | 2 |
局部糜烂 | 3 |
广泛糜烂 | 4 |
B．白细胞浸润（每个高倍视野） | |
无 | 0 |
极少 ＜25个 | 1 |
轻度 26~50个 | 2 |
中度 51~100个 | 3 |
重度 ＞100个 | 4 |
C．血管充血 | |
无 | 0 |
极少 | 1 |
轻度 | 2 |
中度 | 3 |
重度伴血管破裂 | 4 |
D．水肿 | |
无 | 0 |
极少 | 1 |
轻度 | 2 |
中度 | 3 |
重度 | 4 |
刺激反应积分=A+B+C+D
2.3.5.4操作程序
(1)稀释使用的**剂采用黏膜**时应用液5倍浓度的溶液作为受试液。若应用液为原液的**剂则用原液作受试液。对照组采用生理盐水。
(2)将长度为8cm左右的钝头软管与2ml的注射器连接。注射器和导管注满受试液备用。每只动物各准备一套。
(3)一次**黏膜刺激试验的染毒方法：将动物仰面固定，暴露出会阴和**口。将导管用受试液或对照液湿润后轻柔地插入**（4cm~5cm），并用注射器缓慢注入2ml受试液，抽出导管，完成染毒。对照组动物用生理盐水作同样处理。
(4)多次**黏膜刺激试验的染毒方法：按上述2.3.5.4（3））的染毒方法，每隔24h重复染毒一次，连续5d。对照组动物用生理盐水作同样处理。
(5)由于动物**容积的个体差异，有时受试液注入后可能有溢出，可用**棉或软纸拭去。
(6)末次染毒后24h，采用气栓法处死动物，剖腹取出完整的**，纵向切开，肉眼观察是否有充血、水肿等表现，供病理取材时参考。然后将**放入10%福尔马林溶液中固定24h以上，选取**的两端和中央3个部位的组织制片，HE染色后，进行组织病理学检查。
2.3.3.5结果评价
(1)组织病理学检查结果，按表2-16规定对**黏膜的刺激反应进行评分。
(2)将试验组3只动物3个部位的刺激反应积分相加后，再除以观察总数（动物数×3），得出试验组**黏膜刺激反应的平均积分，*大记分为16（见表2-16）。对照组评分方法同上。
(3)将试验组平均积分减去对照组平均积分得出刺激指数后，按表2-17进行刺激强度分级。
(4)当对照组动物**黏膜刺激反应平均积分大于9时，应采用6只动物进行复试，以鉴别是否与操作损伤有关。
表2-17 **黏膜刺激强度分级
**黏膜刺激指数 | **黏膜刺激反应强度 |
＜1 | 无 |
1~＜5 | 极轻 |
5~＜9 | 轻度 |
9~＜12 | 中度 |
≥12 | 重度 |
2.3.6 皮肤变态反应试验
2.3.6.1 目的
检测**剂重复接触后，实验动物产生皮肤变态反应的可能性及其强度。
2.3.6.2 实验动物
选用皮肤完好的健康白色豚鼠，雌雄各半，体重200g～300g。
2.3.6.3 试验分组
将豚鼠随机分为试验组、阴性对照组和阳性对照组，每组动物至少16只。
2.3.6.4 操作程序
(1)对试验组豚鼠，给予受试物诱导和激发处理。阳性对照组给予阳性致敏物(如：2，4-二硝基氯苯)诱导和激发处理。阴性对照组仅给以受试物激发处理。
(2)诱导处理浓度允许引起皮肤轻度刺激反应。激发浓度低于诱导浓度，不得引起原发性刺激反应。如果原液不引起皮肤刺激反应，诱导和激发均使用原液。
(3)于试验前24h将豚鼠背部左侧3cm×3cm范围内去毛。取诱导浓度的**剂溶液(或原液)0.5ml（g），直接涂在2cm×2cm左侧去毛皮肤上或滴于同样大小的2层～4层纱布上，再将其敷贴在左侧去毛区。用一层无刺激塑料膜或油纸复盖，再以无刺激胶布固定，持续6h。第 7d和第 14d以同样方法重复一次。
(4)在末次诱导后14d，将激发浓度的**剂溶液0.5ml（g）直接涂在2cm×2cm右侧脱毛皮肤上或滴于同样大小的2层～4层纱布上，敷贴于豚鼠背部右侧3cm×3cm去毛区。然后，用一层塑料膜或油纸和无刺激胶布固定，6h后将敷贴的受试物洗去。24h和48h后观察皮肤反应，按表2-17对皮肤反应评分。
(5)实验室开展皮肤变态反应试验初期，或使用新的动物种属或品系时，需同时设阳性对照组，阳性对照物可使用2，4-二硝基氯代苯。为保证试验方法的可靠性，在进行该类试验时，每隔半年应使用阳性对照物检查一次。若检测报告中需用非本次阳性对照组的实验数据时，应注明其实验日期。阳性对照组的操作程序同试验组，以阳性致敏物替代受试物。
(6)阴性对照组，仅对动物给予受试物的激发接触，每次试验必须设置。
2.3.6.5 评价规定
化学物质引起的过敏性接触性皮炎，属迟发型变态反应。对于动物，仅见皮肤红斑和水肿。
根据表2-18标准，将出现皮肤反应(评分≥1)的动物数除以该组实验动物数，求得致敏率(%)，按表2-1**定致敏强度。
表2-18 皮肤反应的评分标准
皮肤反应 评分
A 红斑形成:
无红斑 0
轻微红斑 1
中度红斑 2
严重红斑 3
水肿性红斑 4
B 水肿形成:
无水肿 0
轻度水肿 1
中度水肿 2
严重水肿 3
表2-19 致敏强度分级标准
致敏率(%) 致敏强度
0～8 极轻度
9～28 轻度
29～64 中度
65～80 强度
81～100 极强度
注：致敏率为0%时，可判为未见皮肤变态反应。
2.3.7 亚急性毒性试验
2.3.7.1 目的
(1)检测**剂多次接触对实验动物的蓄积毒性作用及其靶器官，并确定其*大未观察到有害作用剂量和*小观察到有害作用剂量。
(2)为亚慢性、慢性毒性或致癌试验的剂量设计提供依据。
2.3.7.2 实验动物
一般用啮齿类动物，优选大鼠。所用大鼠应为 6周龄～8 周龄，每组至少10只，雌雄各半。
2.3.7.3 试验分组
将实验动物随机分为4组(3个剂量组和1个对照组)。选择受试物剂量时，高剂量组应出现明显的毒性反应，但不引起死亡，如果出现动物死亡应不超过10%；中间剂量组应可观察到轻微的毒性效应；低剂量组应不引起任何毒性效应(属未观察到有害作用剂量)。至于具体的剂量设计，可考虑高剂量为LD50的1/5~1/10，高、中、低3个剂量间的组距以3倍~5倍为宜，*低不小于2倍。对于LD50＞5000mg/Kg的**剂，高剂量应用1000mg/Kg。另以受试物溶剂代替受试物进行试验，作为阴性（溶剂）对照组。
2.3.7.4 操作程序
(1)采用灌胃方式经口染毒。
(2)灌胃法每天灌胃一次，每周称体重，并按体重调整受试物的给予量。
(3)试验期为28d~30d，末次染毒后24h检测各项指标，然后处死实验动物，做病理学检查。
2.3.7.5 观察指标
可因**剂毒理作用不同而有差异，一般应包括下列各方面。
(1)临床检查。观察动物中毒表现，每周称量体重一次。
(2)血液学检查。包括血红蛋白含量、红细胞数、白细胞数及其分类计数等。
(3)血液生物化学检查。例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇等。必要时，可根据所观察到的受试物毒性效应，或与受试物化学结构相似物质的毒性作用，选择其他一些生化指标。
(4)脏器重量。测量肝、肾重量，并计算其脏器重量系数（脏器重 / 体重×100%）。
(5)病理学检查。实验结束时，处死所有动物，进行**的肉眼尸检，并将尸检发现的异常组织和主要脏器和组织（如心、肺、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、卵巢和胃肠等）固定保存。当各剂量组动物尸检未发现明显病变时，先进行高剂量组和阴性对照组动物的肝、肾、胃肠和其它可能受损的脏器的组织病理学检查。如发现病变，还应对中、低剂量组动物相应的器官进行组织病理学检查。
2.3.7.6 评价规定
将各试验组动物观察指标与阴性对照组加以比较，并进行差异统计学检验，注意各剂量组间的剂量-反应（效应）关系。评定受试物的*小观察到有害作用剂量和*大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。
2.3.8 致突变试验
2.3.8.1 L5178Y 细胞基因突变试验
2.3.8.1.1 目的
检测**剂对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，以作为评价**剂致突变性的依据。
2.3.8.1.2 试剂
（1）F10P培养液: 为完全培养液。以Fischer或RPMI1640培养液，加入马血清10%，丙酮酸钠220μg/ml，青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml配制而成(pH为7.2～7.4)。于4℃冰箱中保存备用。
（2）F0P培养液:为无血清培养液。以Fischer或RPMI1640培养液，加入丙酮酸钠220μg/ml，青霉素100 IU/ml和链霉素100μg/ml等配制而成(pH为7.2～7.4)。于4℃冰箱中保存备用。
（3)马血清:将过滤**后的马血清，经56℃作用30min灭活补体。分装后，于-20℃保存备用。
（4)集落用培养基:用Fischer或RPMI1640培养液，加入马血清20%、丙酮酸钠220μg/ml、琼脂0.37%配制而成。
（5）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS，pH为7.2～7.4):
磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.20g
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 2.89g
氯化钾(KCl) 0.20g
氯化钠(NaCl) 8.00g
双蒸水(压力蒸汽**) 1000ml
（6)受试物:*好能直接溶于F10P与F0P培养液中。否则需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后再加于上述培养液内。所加DMSO的量应低于1%(V/V)。
（7)阳性对照物:选用甲基磺酸乙酯(EMS)，丝裂霉素C(MMC)，甲基硝基亚硝基胍 (MNNG)，苯并(a)芘 (BaP) 等。
（8）三氟胸苷(TFT):用生理盐水配成100μg/ml溶液，可冻存3个月。
（9）肝微粒体酶混合液(S9 混合液):取健康的雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g左右，约5周龄～6周龄。将多氯联苯(Aroclor1254)，溶于玉米油中，浓度200mg/ml，按500mg/kg体重一次腹腔注射。5d后，断头处死动物，取出肝脏称重后，用预冷的0.15mol/L氯化钾溶液冲洗肝脏数次。每克肝(湿重)加0.15mol/L氯化钾溶液3ml。剪碎肝脏，在冰浴中用玻璃匀浆器制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
将肝匀浆用低温(0℃～4℃)高速离心机，以9000g离心10min。取上清液即为S9，分装于无菌冷冻安瓿中。S9制成后，需进行无菌检查，以及用间接致癌物鉴定其活性。合格者置-80℃或液氮中储存备用，储存期不超过1年。
S9混合液应以上述S9 液在临用时按无菌要求配制。一般配成含10% S9的混合液。其配方如下：
S9 0.10ml
1.65mo1/L氯化钾 + 0.4 mol/L氯化镁 0.04ml
葡萄糖-6-磷酸.2Na 1.8mg
氧化型辅酶 II(NADP) 3.1mg
用F0P培养液补足至 1.0ml
2.3.8.1.3 细胞
试验以小鼠**瘤L5178Y细胞[胸苷激酶(TK) 座位为杂合子 (tk+/tk-)] 检测 TK基因的突变。为减少细胞的自发突变率，在制备该细胞试验用悬液时，先将其在加有 THMG 的 F10P培养液中培养24h，杀灭培养液中所存在的自发突变细胞 (tk-/tk-)，然后将细胞悬浮于THG 培养液(不含氨甲喋呤的 THMG培养液)中培养 1d～3d。
[THMG 含下列4种成分，各成分的终末浓度如下:
胸苷 5×10-6mol/L
次黄嘌呤 5×10-5 mol/L
氨甲喋呤 4×10-7 mol/L
甘氨酸 1×10-4 mol/L]
2.3.8.1.4 试验分组
一般设4个剂量组。对有细胞毒性的受试物，*高剂量组的细胞存活率为10%～20%，无细胞毒性受试物*高剂量不超过10mmol/L或5mg/ml。同时应有阴性（溶剂）对照组、未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，试验组和其它对照组，还均应包括有加S9混合液和不加S9 混合液两大部分。
2.3.8.1.5 操作程序
（1）细胞准备:将新**了自发突变体的细胞群体，用F10P培养液制成悬液。以无菌烧瓶加入细胞悬液和F10P培养液至100 ml，细胞终末密度为7×103个/ml～8×103个/ml。培养物以含5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于37℃进行培养。L5178Y细胞的细胞殖周期约为10h～11h，在常规培养24h后，细胞数将增加约5倍。用稀释法维持生长，每天将细胞培养物用F10P培养液作4倍稀释(或隔天用F10P培养液作24倍稀释)，继续培养。实验前**用F10P培养液和F0P 培养液各50% 的对半混合液(马血清终末浓度为 5%) 稀释。
（2)受试物处理:用上述F10P和F0P 的对半混合液将细胞培养物稀释至1×106 个/ml，并分种于50ml有盖试管中，每管6ml，再加S9混合液4ml(总量共10ml)。不加S9混合液管，代之以F0P培养液。在上述试管内加入一定浓度的受试物，并以含5%二氧化碳的空气充气后加盖密闭，于37℃培养4h。
处理结束后，以200g离心10min，除去含受试物的上清液，收集细胞。细胞用Hanks液洗涤，再加入20mlF10P培养液充分混悬(细胞浓度为0.3×l06 个/ml)，以含 5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于37℃ 振荡培养，开始表达。
（3）表达:细胞的表现型表达时间为2d。表达开始后24和48h经计数后将细胞稀释至3 ×105 个/ml。
（4）选择和集落化:表达结束后，取10ml培养物经离心后除去大部分上清液。并将细胞在留下的约1mlF10P培养基中混悬。将细胞悬液移入含100ml集落培养基的烧瓶中。此时细胞密度为3×l04个/ml。在37℃振荡培养 30min。取出 0.5ml后，向余下的细胞悬液中加入 1.0ml TFT 贮存液，继续振荡培养15min。将样本取出，倒于3个10cm平皿中，每平皿33ml，含1×l06个细胞(称为TFT平板)，作突变体的选择。将先前取出的0.5ml细胞悬液用集落培养基先作1:100稀释，细胞悬液浓度为3×l02个/ml。振荡培养15min 后，取出2.0ml 再用集落培养基作 1:50 稀释(此时细胞悬液浓度为 6个/ml) 后振荡培养。经15min培养后，倒入3个直径为100mm的平皿中，每平皿33ml，含细胞200个(称为VC平板)。待琼脂凝固后，置二氧化碳培养箱(37℃)中静置培养10d。计数各个平皿中出现的集落数，计算集落形成效率(CFE)。
（5)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，仅阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。另设一未处理对照组。
（6)按下列公式计算有关指标:
**CFE = (形成集落数 / 接种细胞数)
相对CFE = (试验组**CFE / 溶剂对照组**CFE) × 100%
突变频率(MF) = (TFT平皿集落数 / VC平皿集落数) × 稀释系数
（在此，稀释系数为 2×l0-4）。
2.3.8.1.6 评价规定
（1）对L5178Y 细胞，推荐可接受的自发突变频率范围为20/106～100/106个存活细胞。
（2）用适当的显著性检验方法进行统计学处理，当各剂量组MF与阴性(溶剂)对照组者相比突变率，有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加并经重复试验证实者，均可判为阳性结果，即受试物对L5178Y细胞 TK 系统有致突变性。
2.3.8.2 V79 细胞基因突变试验
2.3.8.2.1 目的
检测**剂对体外培养的哺乳动物细胞可否引起基因突变，以对**剂的致突变性做出评价。
2.3.8.2.2 试剂
（1）完全培养液：以Eagle*低必需培养液(EMEM)或RPMI1640培养液加10%小牛血清、青霉素 (100IU/ml) 和链霉素 (100μg/ml) 配制而成。
（2)小牛血清:将过滤**后的小牛血清放入56℃水浴中，保温30min以灭活补体，而后分装，保存于-20℃备用。
（3）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS):见2.3.8.1.2（5）。
（4)胰蛋白酶-EDTA溶液:分别用无钙镁 PBS 配制胰蛋白酶与EDTA溶液，胰蛋白酶溶液浓度为0.05%，EDTA溶液浓度为0.02%。两溶液按1:1混合。存放于-20℃ 备用。
（5)受试物:*好能直接溶于无血清培养液内。否则，需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后加于无血清培养液内。所加DMSO溶液量为0.5%(V/V)。
（6)阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物，例如甲基磺酸乙酯(EMS)，丝裂霉素C(MMC)，甲基硝基亚硝基胍(MNNG)，苯并(α)芘(BaP)等。
（7)6-硫代鸟嘌呤(6-TG): 用0.5% 碳酸氢钠溶液配制为1.0mg/mL 溶液，保存于4℃备用。
（8）肝微粒体酶混合液(S9混合液):见2.3.8.1.2 （9）。
（9）姬姆萨染液: 取姬姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375ml，待完全溶解后，再加125ml甘油，放入37℃温箱中保温48h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，2周后使用，作为姬姆萨染液原液。
使用时，取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8) 混合，配成其应用液。
磷酸盐缓冲液(1/15mol/L，pH6.8)配制方法如下:
**液:取磷酸氢二钠9.47g溶于蒸馏水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。
**液:取磷酸二氢钾49.07g溶于蒸馏水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。
取**液49.5ml加于**液50.5ml中混匀，即为pH6.8的1/15mol/LPBS。
2.3.8.2.3 细胞
以中国仓鼠肺(V79)细胞株进行试验。为减少其自发突变，正式试验前将野生型细胞接种于含THMG(见2.3.8.1.3)的MEM培养液内并在二氧化碳培养箱中培养一周，以杀灭自发HGPRT位点突变体。遂后重新接种于MEM培养液中。
2.3.8.2.4 试验分组
一般设4个试验剂量组。对有细胞毒性的受试物，*高剂量组的细胞存活率为10%～20%，无细胞毒性受试物*高剂量不超过10mmol/L(或5mg/ml)。同时，应设阴性（溶剂）对照组、未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，各组均应包括加S9混合液和不加该液的样本。
2.3.8.2.5 操作程序
（1）细胞准备:将5×105个细胞接种于含完全培养液的直径为100mm的平皿中，除未处理对照组外，每组2皿共13皿。于二氧化碳培养箱中(37℃)培养24h。
(2)接触受试物：吸去上述供试培养皿中的培养液，用无钙镁PBS洗2次。将含有细胞的培养皿分为二大组，一组加S9混合液，另一组不加S9混合液。加S9混合液组，在培养皿中加入2mlS9混合液，对不加S9混合液组，则用2ml无血清培养液代替，再加一定量不同浓度受试物的供试液，*后用不含血清的培养液补足至10ml。并将培养皿置CO2培养箱中培养5h，处理结束后，吸去培养皿中液体部分，用无钙镁PBS洗涤细胞2次，再加入完全培养液10ml，在CO2培养箱中培养19h~22h。阳性和阴性(溶剂)对照组也分加与不加S9混合液两大组，操作方法同上。
(3)表达：将培养物用胰蛋白酶-EDTA消化。待细胞脱落后，加入完全培养液，终止消 化。混匀、计数并进行表达和细胞毒性测定[见2.3.8.2.5（4)]。表达时，以5×105 个细胞接种于直径为100mm的平皿中。培养3天后，分传一次，仍接种5×105个细胞，培养3天后再进行突变体的选择及集落形成效率(CFE)的测定。
(4)细胞毒性测定:将上述消化计数后的细胞，每平皿接种200个，每组5个平皿，于二氧化碳培养箱内(37℃)培养7d。取出样本，固定并进行姬姆萨染色后，计数各平皿的细胞集落数。以相对CFE值表示细胞的毒性。
(5)突变体的选择及集落形成率的测定: 表达结束后，消化细胞，分别接种，每组5个平皿，每平皿种2×105个细胞。待细胞贴壁后加入 6-TG，终末浓度为5μg/ml。放入二氧化碳培养箱培养7d～10d。固定后进行姬姆萨染色，计数平皿内集落数，并计算其突变频率(MF)。
(6)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，仅阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。另设一阴性(未处理)对照组。
(7)按下列公式计算有关指标:
** CFE =(形成集落数/接种细胞数)
相对CFE = (试验组**CFE/溶剂对照组**CFE) × 100%
突变频率(MF) = (突变集落数/接种细胞数) ×（1/**CFE）
2.3.8.2.6 评价规定
(1)对V79细胞，推荐可接受的自发突变频率范围为10/106～100/106个存活细胞。
(2)用适当的显著性检验方法进行统计学处理，当各剂量组MF与阴性(溶剂)对照组者相比，突变率有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加并经重复试验证实者，均可判为阳性结果，即受试物对V79 细胞 HGPRT 系统有致突变性。
2.3.8.3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
2.3.8.3.1 目的
用细胞遗传学方法检测体外培养的哺乳动物细胞染色体畸变，评价**剂的致突变性。
2.3.8.3.2 试剂
(1)完全培养液: 采用 Eagle*低必需培养液(EMEM)或Dulbecco *低必需培养液 (DMEM)等，并加入 10%小牛血清以及青霉素(100IU/ml) 和链霉素(100μg/ml)。
(2)小牛血清:将过滤**后的小牛血清，放人56℃恒温水浴中，保温30min灭活补体。处理后分装，保存于-20℃备用。
(3)无钙镁磷酸缓冲液[无钙镁PBS，pH为7.2～7.4。见2.3.8.1.2（5)]。
(4)胰蛋白酶-EDTA:见2.3.8.2.2（4）。
(5)受试物:*好能直接溶于无血清完全培养液内。否则，需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后加于完全培养液内。所加DMSO溶液量应低于1.0%(V/V)。
(6)阳性对照物：加S9时选用环磷酰胺等，不加S9时选用丝裂霉素C等。
(7)肝微粒体酶混合液(S9混合液):见2.3.8.1.2（9)。
(8)秋水仙素溶液(0.04%)：取40mg秋水仙素溶解于100ml无菌0.85%氯化钠溶液中，过滤**。
(9)氯化钾溶液(0.075mol/L)。
(10)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液: 临用现配。
(11)姬姆萨染液:见2.3.8.2.2（9)。
2.3.8.3.3 细胞
可选用中国仓鼠肺（CHL）细胞、中国仓鼠肺 （V79） 细胞、中国仓鼠卵巢 （CHO）细胞，或人外周血**细胞等进行试验。
在一般情况下，本试验推荐使用CHL细胞。 使用CHL 细胞时，在试验前**，将其1×l06个细胞接种于直径为100mm平皿中，置37℃二氧化碳培养箱内待用。
2.3.8.3.4 试验分组
所设试验剂量组应不少于4个。*高剂量组的细胞存活率应为10%～20%，无毒性受试 物*高剂量组不超过10mmol/L(或5mg/ml)。同时，应设阴性(溶剂)对照组、未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，各组均应包括加S9混合液和不加该液的样本。
2.3.8.3.5 操作程序
(1)试验时，吸出细胞培养平皿中的培养液，加入试验所规定浓度的受试物和S9混合物(10%)以及不含小牛血清的完全培养液，放二氧化碳培养箱内作用2h。结束后，吸去完全培养液，用Hanks液洗细胞3次。加完全培养液，再置二氧化碳培养箱中培养，于24h收获细胞。收获细胞之前2h～4h，加入秋水仙素溶液(终末浓度为1μg/ml)，阻断细胞于有丝分裂中期相。
(2)收获细胞时，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，待细胞脱落，加入培养液并混匀 以终止胰蛋白酶作用。离心(1000r/min～1200r/min，5min～7min)，弃去上清液后，加入0.075mol/L氯化钾溶液低渗处理10min～20min。离心后，再以甲醇/冰醋酸液固定2次。按常规滴片干燥，用姬姆萨应用液染色15min 左右。
(3)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，只是阳性对照组用已知染色体断裂剂替代受试物。阴性(溶剂)对照组用受试物的溶剂。另设一未处理对照组。
(4)观察：每组各选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析，观察和记录染色体结构的异常及数量异常。
染色体结构异常可有：断裂，微小体，有着丝点环，无着丝点环，单体互换，双微小体，裂隙，非特定性型变化(粉碎化等)。染色体数量异常可有:非整倍体，多倍体，内复制。
2.3.8.3.6 评价规定
用χ2检验或其他适当的显著性检验方法，对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系时； 或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。
2.3.8.4 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
2.3.8.4.1 目的
检测**剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响，评价**剂的染色体损伤毒性。
2.3.8.4.2 试剂
(1)受试物: 用水、植物油或用0.5%羧甲基纤维素钠配制成溶液或混悬液。
(2)阳性对照物: 常用环磷酰胺或丝裂霉素C。
(3)小牛血清:见2.3.8.3.2（2）。
(4)姬姆萨染液:见2.3.8.2.2（9）。
2.3.8.4.3 实验动物
选用体重为25g～30g的小鼠，雌雄各半，随机分组。
2.3.8.4.4 试验分组
受试物至少设3个剂量组，每个剂量组用10只动物，雌雄各半。另设阴性(溶剂)和阳性对照组。剂量组一般取受试物的1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50等剂量，以得到剂量-反应关系。高剂量组应不引起动物死亡，不引起明显骨髓抑制。若采用一次*大限度试验测得LD50大于5000mg/kg体重，即以5000mg/kg体重为高剂量。
2.3.8.4.5 操作程序
(1)动物染毒采用经口灌胃30h 染毒法，即两次染毒间隔24h，**次染毒后6h取材。
(2)用颈椎脱臼法处死动物，取股骨或胸骨。剥除肌肉，擦净血污。切断股骨或胸骨两端，暴露骨髓腔。
(3)用注射器吸取0.1ml小牛血清，冲洗骨髓腔。用冲洗液常规涂片，晾干或热风吹干。
(4)将已干的涂片，在甲醇中固定5min～10min。用姬姆萨应用液染色10min～15min，然后用pH6.8PBS液冲洗，晾干。
(5)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组。阳性组选用环磷酰胺(40mg/kg体重)或丝裂霉素(1mg/kg～1.5mg/kg体重)。阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂。
(6)选择细胞分布均匀、完整、着色适当的区域。在油镜下计数含微核的嗜多染红细胞（PCE）数。PCE呈灰蓝色[成熟红细胞(NCE)呈粉红色]，微核多呈圆形、边缘光滑、整齐，嗜色性与有核细胞核质一致，呈紫红色或蓝紫色。直径通常为红细胞的1/20～1/5。
(7)每只动物计数1000个PCE。微核细胞率指含有微核的PCE数，以千分率表示。1个PCE中出现有2个或多个微核，仍按1个计数。此外，还应观察PCE/NCE比例，作为对细胞毒性的指标。一般计数200个PCE，同时记数所见到的NCE。当PCE/NCE小于0.1时，提示对骨髓具有明显抑制作用，应降低受试物剂量，重新进行试验。
2.3.8.4.6 评价规定
阴性对照组小鼠，微核细胞率一般不超过0.3%。
用波松分布 u检验或其他适当的显著性试验方法，进行统计学处理。当各剂量组与溶剂对照组相比，微核细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系，或仅一个剂量组微核细胞率增加有显著性意义，并经重复试验证实时，均可判为受试物具有体内染色体损伤作用。
2.3.8.5 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
2.3.8.5.1 目的
用细胞遗传学方法检测实验动物骨髓细胞染色体畸变率，以评价**剂的致突变性。
2.3.8.5.2 试剂
(1)阳性对照物: 常用环磷酰胺，丝裂霉素C等。
(2)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素溶解于100ml无菌的0.85% 氯化钠溶液中，过滤**。
(3)氯化钾溶液(0.075mol/L)。
(4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:临用现配。
(5)姬姆萨染液[见2.3.8.2.2（9)]。
(6)磷酸盐缓冲液(PBS，1/15mol/L，pH7.4)。
2.3.8.5.3 实验动物
成年小鼠(体重25g～30g)，或大鼠(体重180g～220g)。动物总数不少于30只，雌雄各半。
2.3.8.5.4 试验分组
随机分为5组。至少3个受试物剂量组，为1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50。若采用一次*大限度试验，测得LD50大于5000mg/kg体重，即以5000mg/kg体重为高剂量。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组，每组6只动物，雌雄各半。阳性对照组可用环磷酰胺(40mg/kg体重)或丝裂霉素C(1.5mg/kg～2mg/kg体重)。阴性(溶剂)对照组采用受试物溶剂。
2.3.8.5.5 操作程序
(1)用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔24h。于**次染毒后6h处死动物。处死动物前2h～4h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为4mg/kg体重。
(2)用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剔除肌肉等组织。
(3)剪去股骨两端，用注射器吸取5ml生理盐水，从股骨一端注入，用10ml离心管从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。
(4)将骨髓细胞悬液离心(1000r/min，5min～7min)，除上清液。加0.075mol/L氯化钾溶液7m1，用滴管将细胞轻轻混匀，置37℃水浴中低渗处理7min。
(5)加入2ml甲醇/冰醋酸固定液，混匀。离心(1000r/min，5min～7min)，弃上清液。再加入7ml固定液，混匀，固定7min。离心(1000r/min，7min)，弃去上清液。
(6)用同法再固定1次～2次，弃上清液，加入数滴新鲜固定液，混匀。
(7)用悬液滴片，晾干，以姬姆萨应用液染色。
(8)每组各选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析，观察和记录染色体结构的异常和数量的异常。染色体结构异常可有:断裂、微小体、有着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙、粉碎化等。染色体数量的异常可有:非整倍体、多倍体、内复制等。
(9)计算畸变细胞率。畸变细胞率为100个中期分裂相细胞中有染色体畸变的细胞数。一个中期分裂相细胞出现两种或多种畸变，仍按一个有染色体畸变细胞计。
(10)阳性与阴性(溶液)对照组的操作程序同试验组。只是阳性组选用环磷酰胺(40mg/kg 体重)或丝裂霉素(1.5mg/kg～2.0mg/kg体重)作为受试物的替代物。阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂作为受试物的替代物。
2.3.8.5.6 评价规定
用χ2检验或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组畸变细胞率增加有显著性意义，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。
2.3.8.6 程序外DNA修复合成试验
2.3.8.6.1 目的
检测受试物是否可引起体外哺乳动物细胞的原发 DNA 损伤。推荐用放射自显影法进行测定。
2.3.8.6.2 试剂
(1)完全培养液:用Eagle*低要求培养基(EMEM)85份加小牛血清15 份，青霉素(终末浓度100IU/ml)与链霉素(终末浓度100μg/mL)，pH为7.2～7.4。过滤**后，保存于4℃冰箱备用。
(2）同步培养液:用不含精氨酸的EMEM培养基 98 份，加小牛血清 2份，再加青霉素(终末浓度100IU/ml)与链霉素(终末浓度为100μg/mL)配制而成。
(3）小牛血清:见3.11.2.2 2)。
(4）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS):见2.3.8.1.2（5）。
(5）胰蛋白酶-EDTA溶液:见2.3.8.2.2（4）。
(6）甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液:临用现配。
(7）羟基脲(HU)贮备液:250mmol/L。
(8）1% 枸橼酸钠溶液。
(9）3H-胸腺嘧啶核苷
(10）NTB-2 核乳胶或国产核-4乳胶。
(11）肝微粒体酶混合液(S-9混合液):见2.3.8.1.2（9）。
(12)显影液及定影液:包括柯达(Kodak)D-196显影液、停显液及 F-5 定影液。
2.3.8.6.3 细胞
可选用人成纤维细胞、大鼠原代肝细胞、外周血**细胞等进行试验。本规范推荐使用人胚肺成纤维细胞(2BS)。
2.3.8.6.4 试验分组
受试物可设4个剂量组。*高剂量组应使细胞存活率在10%～20%之间。无毒性受试物*高剂量不超过10mmol/ml。同时应有阴性(未处理、溶剂) 对照组和阳性对照组。
2.3.8.6.5 操作程序
人胚肺成纤维细胞(2BS)放射自显影法操作程序。
(1)将细胞增殖至所需数量后，用完全培养液制成单细胞悬液，浓度为0.5×105个/ml～1.0×105个/ml。将细胞悬液接种置有小盖玻片的6孔细胞培养板中，在37℃二氧化碳培养箱内培养1d～3d，至细胞50%融合。每一剂量组和各对照组分别作2个～3个平行样本。
(2)换用同步培养液，培养 3d。
(3)在试验的前一日下午，加入羟基脲(HU)贮备液使HU的终末浓度为10mmol/L。继续在37℃下培养16h，然后将上述长有细胞之盖片置于含有不同浓度的受试物、HU(10mmol/L)及3H -胸腺嘧啶核苷(5μCi/ml～10μCi/ml，30Ci/mmol)同步培养液中。在37℃培养5h。
(4)阳性及阴性对照组的操作程序同试验组，只是阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。
(5)处理结束后，用Hanks液洗涤3次，再用1%枸掾酸钠溶液处理10min。将小盖玻片用甲醇-冰醋酸固定液固定30min，重复2次。干燥过夜，将有细胞的盖玻片用少量中性树胶，粘固于载玻片上，长有细胞的一面朝上。
(6)在暗室中，将适量之NTB-2乳胶(或核-4乳胶)移入浸渍用之玻璃器皿中，置40℃水浴中融化，再加入等量40℃蒸馏水，继续在水浴中加温，用玻璃棒轻轻搅拌10min～20min，使气泡逸出。同时将准备做自显影处理的载玻片，置水浴箱平台上预热。而后，将附有样本的载玻片垂直浸渍于乳胶液中约5s。提出玻片，拭去其背面乳胶并待其干固。
(7)将干固的附有样本的载玻片置于有变色硅胶干燥剂袋的曝光盒中，盒外包黑色避光纸，于4℃冰箱中曝光10d。曝光后，将玻片在D-19显影液中显影4min，在停显液中漂洗30s，在F-5定影液中定影10min，再用水漂洗数小时。
(8)细胞在显影后用姬姆萨染液染色，脱水透明后，用盖片封固。在油镜下，计数各样本细胞核的显影银粒数，每个样本计数100个细胞，同时计数相当面积的本底银粒数，两者之差为细胞核净银粒数。计算各试验组和对照组"银粒数/核"的均值及其标准差。
2.3.8.6.6 评价规定
用t检验或其他适当的显著性检验方法进行统计学处理。当各试验剂量组"银粒数/核"均值与阴性(溶剂)对照组者相比，有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有统计学意义的增加，但经重复试验证实者，可判为该受试物诱导了DNA修复合成，具有DNA损伤作用。
2.3.8.7 小鼠精子畸形试验
2.3.8.7.1 目的
以哺乳动物体内试验，检测受试物对雄性生殖细胞的遗传毒性(精子形态异常)。
2.3.8.7.2 试剂
(1)受试物: 常用水、植物油，或用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液。
(2)阳性对照物:常用环磷酰胺或丝裂霉素C。
(3)甲醇（优级纯）。
(4)2.5%伊红溶液:称取伊红2.5g，溶于 100 ml蒸馏水中备用。
2.3.8.7.3 实验动物
成年雄性小鼠至少25只，体重25g～35g。
2.3.8.7.4 试验分组
设3个试验剂量组，*高剂量可取*大耐受量，或分别取1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50。若采用一次*大限量试验，测得LD50大于5000mg/kg体重，即以5000mg/kg体重为高剂量。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组。每组5 只动物。
2.3.8.7.5 操作程序
(1)小鼠灌胃染毒。连续 5d，每天 1 次。
(2)**染毒后 35d，用颈椎脱臼法处死动物，剖腹，取出附睾。
(3)将附睾放入盛有2ml生理盐水的平皿中，用眼科剪剪碎。以3层擦镜纸过滤，取滤液离心(1000r/min，5min)。
(4)除上清液。加入少量生理盐水，以混悬液涂片。自然干燥。甲醇固定5min，用伊红溶液染色1h。
(5)在高倍显微镜下，每只动物计数1000个精子中的畸形精子数。精子畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。分别记录其畸变类型，以统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。
(6)阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺(每天40mg/kg～60mg/kg体重)，或丝裂霉素C(每天1.0mg/kg～1.5mg/kg体重)。阴性对照组为受试物溶剂对照。其他操作程序同试验组。
2.3.8.7.6 评价规定
用χ2检验或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，精子畸形率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物对雄性生殖细胞具有遗传毒性。
2.3.8.8 睾丸生殖细胞染色体畸变试验
2.3.8.8.1 目的
利用细胞遗传学方法，以哺乳动物体内试验检测受试物引起的生殖细胞染色体损伤。试验有小鼠精原细胞染色体畸变试验和小鼠精母细胞染色体畸变试验，可根据情况选做其一，或两者均做。
2.3.8.8.2 试剂
(1)受试物: 用水、植物油配成溶液，或用 0.5% 羧甲基纤维素钠制成混悬液。
(2)阳性对照物: 常用环磷酰胺，或丝裂霉素。
(3)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素，溶于100ml 0.85% 氯化钠溶液中，过滤**。
(4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:临用现配。
(5)枸掾酸三钠。
(6)姬姆萨染液:见2.3.8.2.2（9）。
2.3.8.8.3 实验动物
选用3月～4月龄，体重25g～30g 的雄性小鼠。动物总数不少于25 只。
2.3.8.8.4 试验分组
受试物至少设3个试验剂量组，每个剂量组5只动物。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组。阳性对照组用环磷酰胺(40mg/kg体重)或丝裂霉素C(1.5mg/kg～2mg/kg体重)，腹腔注射。
2.3.8.8.5 操作程序
(1)小鼠精原细胞染色体畸变试验，用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔24h。于**次染毒后6h处死动物。处死动物前3.5h～5.0h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为4mg/kg体重。
小鼠精母细胞染色体畸变试验，灌胃染毒，每天1次，连续5d。于第1次染毒后的第12d～14d将受试动物处死。处死动物前3.5h～5.0h，腹腔注射0.04%秋水仙素溶液(4mg/kg体重)。
(2)用颈椎脱臼法处死小鼠，取睾丸，去除脂肪。置含2.2%枸橼酸三钠溶液平皿中去除睾丸被膜，用针头使曲精小管松散。一个动物的2个睾丸可分别或合并处理。
(3)用吸管尽可能去除2.2% 枸橼酸三钠溶液，将曲精小管置于含3ml～4ml 低渗液(1%枸 橼酸三钠)的试管中。10min后更换低渗液，以去除碎片和精子。在室温下，低渗时间总计不超过25min。低渗结束后去除低渗液。加入预冷的固定液(甲醇/冰醋酸)，固定10min后，更换固定液，再固定10min。第3次固定至少30min，也可在冰箱中过夜。用镊子将已固定的曲精小管移到含50%醋酸5ml的离心管中，吸管吹打至不透光，离心(1000r/min，5min)。
(4)将固定液1.0ml～1.5ml加至离心所得细胞沉淀物中。滴管吹打后，滴2 滴至用70%乙醇浸湿的玻片，分散后，热风干燥。
(5)用姬姆萨应用液在室温染色10min，自来水淋洗两次。
(6)以油镜检查染色体结构的异常情况。每只动物做两个睾丸，每个睾丸分析50个中期分裂相精原细胞(或精母细胞)。记录观察染色体型和染色单体型染色体的结构异常。对精母细胞染色体还观察相互易位、X-Y和常染色体的单价体。
检查染色体数目异常时，记录非整倍体和多倍体。在小鼠精母细胞染色体畸变试验时，只有当**次减数分裂中，四倍体生殖细胞有一个被确认为四价体时才有意义。
2.3.8.8.6 评价规定
用χ2检验，或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有显著性意义的增加，经重复试验证实后，可判为该受试物对哺乳动物睾丸细胞具有致突变性。
2.3.9 亚慢性毒性试验
2.3.9.1 目的
（1)检测**剂较长期染毒对实验动物的毒性作用及其靶器官，并确定其*大未观察到有害作用剂量。
（2)为慢性毒性和致癌试验的剂量设计提供依据。
2.3.9.2 实验动物
一般用啮齿类动物，优选大鼠。所用大鼠应为 4周～6 周龄者。全部试验至少需用 80 只动物。
2.3.9.3 试验分组
将实验动物随机分为4组(3个剂量组和1个对照组)，每组20只动物，雌雄各半。选择受试物剂量时，高剂量组应出现明显的毒性反应，但不引起死亡，如果出现动物死亡应不超过10%；中间剂量组应可观察到轻微的毒性效应；低剂量组应不引起任何毒性效应(属未观察到有害作用剂量)。至于具体的剂量选择，可考虑高剂量为LD50的1/20~1/5，高、中、低3个剂量间的组距以3倍~5倍为宜，*低不小于2倍。另以受试物溶剂代替受试物进行试验，作为阴性对照组。
2.3.9.4 操作程序
（1）采用灌胃方式或将受试物掺入饲料经口染毒。
（2）灌胃法每天灌胃1次，每周称体重，并按体重调整受试物给予量。如受试物掺入饲料时，应定期称饲料消耗量，计算**剂摄入量。
（3）试验期为3个月(90d)，末次染毒后24h检测各项观察指标，然后处死实验动物，做病理学检查。
2.3.9.5 观察指标
观察指标，可因**剂毒理作用不同而异，一般至少包含以下方面。
（1）临床观察：观察动物中毒表现，每周称量体重1次，食物消耗量至少1次~2次。
（2)血液学检查：包括血红蛋白含量、红细胞数、白细胞及其分类计数、血小板数、网织红细胞数等。
（3)血液生物化学检查：例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇、总胆红素等。必要时，可根据所观察到的受试物毒性效应，或与受试物化学结构相似物质的毒性作用，选择其他一些生化指标。
（4)脏器重量：测量主要脏器(如肝、肾、肾上腺、睾丸等)的脏器重量和脏器系数。
（5)病理学检查：实验结束时，处死所有动物，进行系统解剖和肉眼观察，并将主要器官和组织（如心、肺、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、卵巢、胃肠和系统解剖时发现的异常组织等）固定、保存。当各剂量组动物尸检未发现明显病变时，先进行高剂量组和阴性对照组动物肝、肾、胃、肠及其它重要的和可能受损的脏器的组织病理学检查。如发现病变，还应对中、低剂量组动物相应的器官进行组织病理学检查。
2.3.9.6 评价规定
将各试验组动物观察指标与阴性对照组加以比较并进行统计学检验，注意各剂量组间的剂量-反应（效应）关系。评定受试物*小观察到有害作用剂量和*大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。
2.3.10 致畸胎试验
2.3.10.1 目的
检测**剂对妊娠实验动物有无致畸胎性，确定其未观察到发育毒性的剂量。
2.3.10.2 试剂
（1)1/1000茜素红溶液:茜素红0.1g，氢氧化钾10g，加蒸馏水1000m1。
（2)透明液A:甘油200ml，氢氧化钾10g，蒸馏水790ml。
（3)透明液B:甘油与蒸馏水等量混合。
（4)固定液(Bouins液):苦味酸饱和液75份，甲醛20份，冰醋酸5份。
2.3.10.3 实验动物
试验用大鼠或小鼠(必要时可用家兔)。用大鼠和小鼠试验时，取健康、性成熟、未交配过的体重为200g～250g的大鼠，或体重为25g～30g的小鼠。
2.3.10.4 试验分组
至少设4组，其中3个为试验组，1个为阴性对照组。每组至少有15只孕鼠。高剂量组可用雌鼠的1/10LD50作为试验剂量；低剂量组，可用雌性动物的1/100LD50作为试验剂量。其间设中剂量组。阴性对照组以受试物的溶剂代替受试物进行试验。阳性对照组常用阿司匹林(300mg/kg体重)、敌枯双(1mg/kg体重)或维生素A(40000IU)。对于实验室**进行的种或品系必需设阳性对照组。为了保证试验方法的可靠性，每隔半年需用阳性对照物检查一次。
2.3.10.5 操作程序
（1）将雌鼠和雄鼠按 1:1 或 2:1的比例同笼饲养。每日晨观察阴栓(或**涂片)。查出阴栓或精子的当天定为孕期零天。如5d内未交配，调换雌鼠。查出的孕鼠按上述随机分组，并进行称重和编号。
（2）在大、小鼠孕期6d～15d期间，每天用灌胃法给予受试物。分别于孕期0d、6d、10d、15d和20d称重孕鼠，并根据体重调整受试物给予量。注意观察并记录孕鼠的毒性反应。
（3）大鼠于孕期第20d，小鼠于孕期第18d，用颈椎脱臼法处死。剖腹，取出**称重，检查活胎、吸收胎、早期死胎和晚期死胎数。
（4)逐个记录活胎鼠的性别、体重、身长和尾长。外观检查头面部、躯干部、四肢等有无畸形，诸如皮下出血、露脑、脑膨出、眼部畸形(无眼或开眼等)、鼻孔扩大、单鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢和尾畸形、**闭锁等。
（5）每窝取约1/2～2/3活胎鼠，用眼科镊剥皮。取出内脏(注意勿拉断肋骨)，去掉后颈和两肩胛骨之间的脂肪块。将胎鼠放入茜素红溶液染色。当天摇动玻璃瓶2次～3次。待骨骼染成红色时为止。将胎鼠换入透明液A中1d～2d，换入透明液B中2d～3d。待胎鼠骨骼已染红，而软组织的紫红色基本褪去，可换置甘油中。
（6)将染好的标本连同甘油一并倒入含水平皿内，在解剖显微镜下，用透射光源，先观察胎鼠全身，然后逐步检查:①头骨、胸骨、脊椎骨、肋骨和四肢等有无骨化不全、骨化迟缓和其他缺陷。②观察脊椎骨有无缺失、融合、纵裂等畸形；③观察胸骨的发育和数目，有无胸骨缺失等；④检查肋骨有无融合肋、分叉肋、肋骨中断、缺肋、短肋、波状肋、多肋畸形等；⑤*后检查四肢骨畸形。
（7)每窝取约 1/3～1/2 活胎鼠浸入固定液2周，作内脏检查。将已固定的胎鼠用水冲净，仰放于石蜡板上。剪去四肢和尾，用刀片在头颈部常规共切4刀，再用剪刀剖开胸、腹腔。着重检查:①有无裂舌、双叉舌、裂腭及眼、鼻和脑部的畸形；②是否出现右位心、心脏过大、肺过大或过小等畸形；③消化系统和泌尿生殖系统各器官的大小、形状以及位置； ④ 有无肾盂积水，双侧有无睾丸，以及**发育不全等畸形。
2.3.10.6 评价规定
主要观察动物畸胎出现率，同时观察其他指标，如着床数、活胎数、晚期死胎数、早期死亡数，以及活胎体重、身长、尾长等。
观察全部结果的剂量-反应关系，确定受试物的母体毒性、发育毒性及致畸性。求出受试物的*小致畸剂量和*大无致畸作用剂量。对致畸强度应以致畸指数表示。
致畸指数= (雌鼠LD50)/(*小致畸剂量)
致畸指数小于或等于10为基本不致畸；大于10至100为致畸；大于100为强致畸。
2.3.11 慢性毒性试验
2.3.11.1 目的
检测受试物长期染毒对实验动物所产生的毒性作用，确定其*小观察到有害作用剂量，*大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。
2.3.11.2 实验动物
试验选用刚离乳的大鼠。在试验结束时，每个剂量组每种性别的动物应不少于10只。中间需活杀动物检查时，需相应增加实验动物数量。
2.3.11.3 试验分组
将实验动物随机分在3个剂量组和1个阴性对照组。阴性对照组除不接触**剂外，其它与实验组相同，若在试验中对受试物使用溶剂或赋形剂时，阴性对照组应给予相应剂量的溶剂或赋形剂。试验剂量根据亚慢性试验结果选择。高剂量应引起明显的毒性效应甚至个别动物死亡，低剂量应不引起毒性效应。
2.3.11.4 操作程序
（1)用灌胃法或将受试物掺入饲料或饮水中喂饲。掺入饲料的受试**剂的*高浓度一般不超过5%。饲料中受试**剂应定期监测，观察其均匀性和稳定性。
（2）灌胃法每天给药一次。
（3）前3个月每周称量体重，3个月后每月称1次体重，调整受试物灌胃量。如受试物掺入饲料，应定期称饲料消耗量。如受试物溶于饮水中喂饲，需记录动物的饮水量。
（4)试验期限为一般为6个月，必要时可延长至2 年。
2.3.11.5 观察指标
指标与亚慢性毒性试验基本相同，也可根据受试物对实验动物的亚慢性毒性作用和靶器官，可适当增加或更换一些针对性更强更灵敏的观察指标。
（1）临床观察：观察中毒表现，体重前3个月每周1次，以后每月1次。
（2）血液学检查：于试验的第3个月、6个月及以后每半年进行1次血液学检查。
（3）血液生化检查：检查时间同血液学检查。
（4）病理学检查：
系统解剖：所有实验动物包括试验过程中死亡的动物都应进行完整的系统解剖和详尽的肉眼观察。肉眼可见的异常组织都应留样作进一步组织病理学检查。
脏器重量：称取脑、肝、肾、肾上腺和睾丸重量并计算脏器系数。
组织学检查：对照组、高剂量组动物及系统解剖发现异常的组织均需作详尽的组织学检查。当高剂量组有异常发现时，其它剂量组才进行相应检查。检查脏器一般包括脑、心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、肾上腺、甲状腺、垂体、睾丸（卵巢）和**等。
2.3.11.6 评价规定
比较各剂量组与对照组观察指标的变化。计算分析其剂量-反应关系，并确定受试物*小观察到有害剂量和*大未观察到有害作用剂量，及毒性作用靶器官。
2.3.12 致癌试验
2.3.12.1 目的
检测长期接触**剂后实验动物出现肿瘤的情况，评价其致癌性。也可将致癌试验和慢性毒性试验结合在一批动物中进行。
2.3.12.2 实验动物
以刚离乳的大鼠或小鼠进行试验。如与慢性毒性试验结合进行，通常选用大鼠。各剂量组和阴性对照组使用的有效动物数，至少雌雄各50只。如与慢性毒性结合进行，试验中间需处死动物进行检查时，需相应增加实验动物数。
2.3.12.3 试验分组
实验动物分组同慢性试验，一般设3个剂量组与1个阴性对照组(见2.3.11.3)。根据亚慢性试验结果选择剂量。*高剂量组为*大耐受剂量，可引起轻度毒性效应，但不能因肿瘤以外因素明显缩短其生命期限。*低剂量组应不影响动物正常的生长、发育和寿命，即不引起任何毒性效应。中间剂量处于*高和*低剂量之间。若在试验中对受试物使用溶剂或赋形剂时，阴性对照组应以相应的溶剂或赋形剂进行试验。
2.3.12.4 操作程序
（1）将受试物灌胃或掺入饲料或饮水中喂饲。掺入饲料中的受试物*高浓度，不应超过 5%。如用灌胃法，每天给药1次。
（2）前3个月每周称体重，3个月后每月称体重，并调整受试物的灌胃量。每周称饲料消耗量1次。若受试物溶于饮水中喂饲，需记录饮水量。试验期应包括动物正常寿命期的大部分时间，大鼠为2年以上，小鼠为18个月以上。
（3)试验过程中，除观察一般临床症状外着重观察动物的肿瘤发生情况。对每一肉眼可见或可触及的肿瘤，其出现的时间、部位、大小、外形和发展情况均应有记录。
（4）凡在试验过程中死亡或濒死而提前处死，以及试验结束全部处死的动物，均应进行完整的尸检及系统的、**的、详细的器官和组织的病理学检查。对肉眼可见肿瘤或可疑病变组织，对试验过程中死亡或濒死而提前处死的动物，高剂量组和对照组的全部动物，均需进行**的病理组织学检查。如果高剂量组肿瘤、癌前病变或增生的发生率和阴性对照组者相比，差别有显著性时，则中、低剂量组所有动物的有关器官和组织均需进行病理组织学检查。若高剂量组存活动物数显著少于对照组或存在影响肿瘤发生的毒作用时，则中剂量组也应按上述高剂量组的要求进行系统检查。
（5）若致癌试验和慢性毒性试验结合一起进行，还应按慢性毒性试验的要求，对有关指标进行观察和记录。
2.3.12.5 评价规定
（1）肿瘤发生率：肿瘤发生率是整个实验终了时，患瘤动物总数在有效动物总数中所占的百分率，有效动物总数是指*早出现肿瘤时的存活动物总数。
实验终了时患瘤动物总数
肿瘤发生率= ×100%
有效动物总数
（2）致癌试验阳性的判断标准：按世界卫生组织(WHO，1969)提出的下列 4条致癌试验阳性标准进行评价。
1）阴性对照组动物出现的一种或数种肿瘤，试验组均有发生且发生率超过前者。
2）试验组发生阴性对照组未有的肿瘤。
3）试验组肿瘤发生的时间早于阴性对照组者。
4）试验组每个动物的平均肿瘤数超过阴性对照组者。
(3)致癌试验阴性结果的确立
假如动物试验规模为两种种属、两种性别，至少3个剂量，其中一个接近*大耐受剂量，每组动物至少50只，实验组肿瘤发生率与对照组无差异。
(4）试验报告：在结果报告中，应写明所发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，其它毒性效应，以及剂量-反应关系及统计学分析结果。
2.3.13毒理学试验结果的*终判定
2.3.13.1 **阶段试验结果的判定
（1）在急性经口毒性试验中，LD50＞5000mg/kg体重，可通过；对于稀释使用的**剂，当LD50≤5000mg/kg体重时，则需增做**剂*高应用浓度5倍的急性经口毒性试验。增做的试验结果，如果LD50＞5000mg/kg体重，可通过；否则，应增做**剂原形样品的亚慢性毒性试验。
（2）在急性吸入毒性试验中，LC50＞10000mg/m3者，属于实际无毒，可通过；否则，应放弃使用。
（3）在皮肤刺激试验中，如结果为无刺激或仅具轻度刺激作用，可通过；否则，应放弃使用。
（4）在急性眼刺激试验中，如结果对眼无刺激性或具有轻刺激性，可通过；否则，应放弃使用。
（5）在**黏膜刺激试验中，如结果对**黏膜无刺激性或极轻度刺激性，可通过；否则，应放弃使用。
（6）在皮肤变态反应试验中，如**剂对皮肤仅具有极轻度的致敏作用，可通过；否则，应放弃使用。
2.3.13.2**阶段试验结果的判定
（1）在亚急性毒性试验中，如各剂量组均未观察到毒作用，可通过；否则，根据试验的*小观察到有害作用剂量或*大未观察到有害作用剂量（以mg/kg计），再参考**剂的毒理作用特点和使用条件，由专家评定。
（2）致突变试验结果的判定
对**类**剂所进行的分别反映基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平的3种类型致突变试验中，如有2种或3种类型试验结果为阳性，该**剂应放弃，不必继续进行试验。如果仅一种类型试验为阳性，应再增做另一项同类型致突变试验。若其结果仍为阳性，该**剂亦应放弃使用。
对**类**剂所进行的分别反映基因水平和染色体水平类型的两项致突变试验中，如均为阳性，该**剂应放弃使用，不必继续进行试验。若仅一种类型试验为阳性，应再增做另一项同类型致突变试验，如结果为阴性，可通过；否则需进入第三阶段或第四阶段试验。
对第三类**剂所进行的反映基因水平或体细胞染色体水平类型一项致突变试验中，如结果为阴性，可通过；如结果呈阳性，应再增补另一种类型的一项致突变试验，若仍为阳性，该**剂应放弃使用。
2.3.13.3 第三阶段试验结果的判定
根据亚慢性毒性试验和致畸胎试验中的*小观察到有害作用剂量或*大未观察到有害作用剂量(以mg/kg体重计)，再参考**剂的毒理作用特点和使用条件，由专家评定。
2.3.13.4 第四阶段试验结果的判定
根据慢性试验中的*小观察到有害作用剂量或*大未观察到有害作用剂量(以mg/kg计)，或在任何一个剂量组发现有致癌作用，均需由有关专家评议作出结论。
2.3.13.5以上各项为**剂**性毒理学评定的基本原则。对特殊情况，应由有关专家评议作出结论。
