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显色剂
日期：2024-05-17 03:25
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摘要：
显色剂
1 无机显色剂
无机显色剂在比色分析中已经应用不多，主要因为生成的络合物不够稳定，灵敏度和选择性也不高。目前主要应用较多的有硫氰酸盐、钼酸铵和过氧化氢等。
2 有机显色剂
大多数有机显色剂与金属离子生成极稳定的鳌合物，而且具有特征的颜色，因此选择性和灵敏度都较高。不少鳌合物宜溶于有机溶剂，可以进行萃取比色，这对进一步提高灵敏度和选择性很有利。
有机显色剂大都是含有生色团和助色团的化合物。在有机化合物分子中，一些含有不饱和键的基团，它们能吸收大于200nm波长的光这种基团称为广义的生色团。
有机显色剂的种类繁多，如OO型鳌合显色剂、NN型鳌合显色剂、含S的显色剂、偶氮类鳌合显色剂、三苯甲烷类鳌合显色剂等。显色剂的分子结构及用途可在分析化学手册上查到。
1 测量误差
许多误差来自吸光度的定量测定。光度测定过程包括两个阶段：**阶段是化学过程，即利用各种化学反应将待测组分的溶液用适当的试剂处理，使待测组分转变为一定组成的化合物，包括有色化合物及各种络合物；**阶段是物理过程，即将经**阶段处理的样品置于仪器中测定吸光度或绘制吸收光谱。因此，测定过程中的误差可以分成化学的、物理的和人为的三种原因。
1.1 化学误差
（1） 平衡效应
化学分析中大多数是基于被测定成分与试剂之间的反应，从而得到一定的反应产物。其测定方法可分为两类，一类是测量所得到的化合物的量；另一类是测量所消耗的试剂量，从而间接测定待测组分的量。它们都广泛地牵涉到各种化学平衡，也就是说，在体系中待测物质是与其他化学成分处于平衡之中。为了确切求得吸收定律中待测成分的浓度值（c），尽管不是真实的，但浓度c必须等于或正比于总的或分析的浓度。因此，了解各种平衡的影响是重要的。举例证明如下。
1） 二聚平衡：重铬酸钾在可见光区450nm处有吸收。假定0.1000mol/L的K2CrO4溶液用水稀释2、3和4倍，显然，将分别得到0.0500，0.0333和0.0250mol/L溶液。假如将这些溶液于450nm处测量其吸光度并制作标准曲线，结果将大大偏离吸收定律。这种偏离被认为是来源于下述平衡：
Cr2O72－（橙色）＋H2O2HCrO4－2H+＋2CrO42－（黄色）
对大多数波长来说，重铬酸根离子的摩尔吸光系数相差很大，因此，反应式中平衡的任何移动将影响所测定的吸光度。当0.1000mol/LCr2O72－离子严格地稀释2倍时，Cr2O72－离子的浓度不是0.0500mol/L，而是明显地小了，因为反应式的平衡由于稀释而移向右边。控制反应式平衡的*好方法是将它配制在KOH溶液中，使Cr（Ⅵ）实际上全部转变为CrO42－离子。这时吸收定律将得到遵从，而且溶液是稳定可靠的，这种溶液常作为用来校正对吸收定律可能产生偏差的标准物质。
2） 酸—碱平衡：假如一种吸收成分是包括在一个酸—碱平衡之中，吸收定律将失效，除非将pH值和离子强度保持不变，或者在等吸收点进行测量。两个成分相互平衡，在某一波长处呈现相同的吸光系数，该波长称为等吸收点。pH效应在光度测定中广泛存在，因为许多化合物的吸收光谱随H＋活度的不同而显著改变，小到0.1pH的改变都足以引起5%的误差。
溶液中酸碱度的影响表现在许多方面。
l 由于pH值的不同，形成具有不同的配位数、不同颜色的络合物。这种情况在金属离子与弱酸阴离子形成较稳定的络合物时常遇到。随着pH值的增大，溶液颜色可能发生变化，这是由于在酸性溶液中所生成的通常是简单的络合物，但并没有达到阳离子的*大配位数。当pH值增大时，游离的阴离子浓度亦相应增大，这就可能生成具有较高配位数的化合物。例如：铁离子与水杨酸在不同pH值时生成的络合物为
pH<4 Fe(C7H4O3)+ 紫色
4< pH<9 Fe(C7H4O3)2－ 红色
9<pH Fe(C7H4O3)33－ 黄色
应用这一类反应进行测定时，准确保持溶液的pH值是很重要的。
l 氧化还原反应的方向与溶液的酸度有很大关系。例如，当铬酸盐量很小时，则溶液不呈明显的黄色，但可应用二苯卡巴肼，它在酸性溶液中被铬酸盐氧化为蓝紫色的化合物而进行光度测定。由于铬酸盐的氧化电位与氢离子浓度有很大关系，因此，在中性或碱性溶液中，由于氧化势的降低，即使溶液中的铬酸盐的浓度达0.1mol/L时也不能将二苯卡巴肼氧化成蓝紫色化合物。
l 由于pH值的升高而引起金属离子的水解。当有色络合物的稳定度不很大和被测定金属离子的氢氧化物溶解度很小时，增大溶液的pH值，由于生成金属的氢氧化物而破坏了有色络合物，使溶液的颜色减弱或完全褪色。例如，
Fe(CNS)2+＋OH－Fe(OH)2+十CNS－
l 提高酸度而使有色络合物分解。pH值太高会引起金属离子水解，pH值太低又会使有色络合物分解，特别是对于金属离子与弱酸阴离子形成的络合物。这类络合物被酸分解的反应为
MR十H+ M+＋HR
K平衡 = =K络 K酸
[H＋] = [HR]× × (2-7)
由2-7式可知，弱酸的酸性愈强(即K酸愈大)或所生成的络合物愈稳定(即K络愈小)，所加入的过量试剂浓度愈大，则溶液中可允许的酸度愈大。
总之，pH效应是多方面的，因此，控制溶液的pH值是必要的，一般的方法是采用合适的缓冲溶液。
3） 络合平衡：光度分析中广泛应用络合反应，尤其在无机元素的测定中更为普遍。因此要求所形成的络合物具有高稳定性，才能使待测离子更容易完全转变为络合物。这不仅在准确度方面是重要的，而且在测定灵敏度方面也是重要的，同样溶液中存在的其他离子对测定的影响也就愈小。这说明了络合物的稳定性对分光光度分析具有重要意义。络合物的稳定度是由络合物的中心离子与配位体间的化学亲和力来决定的。当然，它与各离子的特性，如离子半径、离子电荷及外层电子结构有密切的关系。人们虽然不能改变这些待测离子的内部性质，但是，从某些重要因素着手，如选择适宜的试剂，控制反应条件(pH、溶剂等)，还是可以使反应平衡向有利的方向改变而建立起良好的分析方法。
（2） 溶剂效应
在紫外—可见光分光光度分析中广泛使用各种溶剂，溶剂效应对于发色团的吸收峰的强度和波长位置的影响是个很重要的问题。众所周知，将碘溶于四氯化碳(介电常数=2.24)中就得到深紫色溶液，而溶于乙醇(介电常数=25.8)中就得到红棕色溶液，它的吸收峰位置及强度都有很大变化。改变溶剂对一个给定溶质的吸收的影响在一般方法中是无法准确预料的，但是溶剂的光谱效应取决于发色团的电子跃迁类型和溶剂—溶质体系的性质却是无疑的。
溶剂效应不仅在于溶剂的光谱效应是一个复杂而又特殊的问题，而且它的影响涉及到吸收峰的位置、强度、谱带宽度以及精细结构等方面，对定性和定量分析工作都是极端重要的，它也直接关系到标准谱图的比较和方法的灵敏度、选择性以及准确度。因此，在选择溶剂时，首先必须考虑到它的透明度（即在测定的波长范围内无吸收），而且对溶剂可能影响光谱的一些性质，如介电常数、极性、偶极矩、折射指数、酸碱性等等也必须有所了解。很明显，为了定性的目的而对光谱进行比较时，需要使用与标准光谱同一种溶剂，这是很重要的。在一般情况下，→π*跃迁的谱带如果溶剂由己烷改为乙醇，大约红移10nm—20nm；相反，丙酮的→π*谱带由己烷改为乙醇大约蓝移7nm，当改用水为溶剂时，则蓝移8nm。因此，人们将尽可能采用非极性溶剂记录溶液的吸收光谱。表2-2为某些溶剂的近似截止波长（假设光程为1cm），低于此波长时它们就不能使用。实际中这些波长的*低值很大程度上取决于溶剂的纯度。
表2-2 一些溶剂的近似截止波长
溶剂 | 极限波长，nm |
水 | 200 |
乙醇（95或100%） | 195 |
甲醇 | 195 |
乙醚 | 205 |
异丙醇 | 210 |
环己烷 | 212 |
异辛烷 | 215 |
氯仿 | 245 |
四氯化碳 | 262 |
苯 | 280 |
二甲苯 | 290 |
吡啶 | 305 |
丙酮 | 328 |
二硫化碳 | 375 |
（3） 试剂和溶剂中的杂质
分光光度法是很灵敏的方法，溶剂(包括蒸馏水)和试剂中的吸光杂质都会引起不同程度的误差（甚至试剂级化学药品有时也是不适用的，即使通过扣除空白值也不能解决问题），其原因是有些杂质不仅能吸光，而且还能影响反应速度和发色团的产率（增色或减色），甚至参与反应。在许多带羟基的溶剂或试剂中含有杂质醛是一个主要的问题。如在用3-甲基-2-苯并噻唑灵酮腙的分光光度法中，使用受醛污染的2-甲氧基乙醇为溶剂时空白值比较高。在用苯肼和硫酸测定17-羟基皮质甾(类)时，使用受醛污染的丁醇为溶剂，将导致一个负反应。其他影响如在用间苯二酚为试剂的果糖测定中，当使用纯的乙醇或乙酸为溶剂时，λ*大在480nm；当使用的乙酸被痕量的乙醛污染时，λ*大改变到550nm。
（4） 试样中的干扰物质
所谓干扰物质是指对于显色反应有影响的物质，这些物质在一定程度上与试剂发生反应，它在待测成分所选定的波长区间内有不可忽视的吸收作用，因而使摩尔吸光系数或吸光度产生变化。通常有如下几种类型，①干扰物质与待测成分争夺试剂。②干扰物质与待测成分起化学反应或产生有色的生成物。③干扰物质间接作用。为消除干扰或减少误差到*小，通常采用：
1） 分离除去干扰物。这种方法因为花时间、费力气，有时还可能增加误差，故一般不予采用。如能应用液-液萃取或色谱法以除去干扰物，还是可行的。
2） 转化干扰物质成为非干扰物质。这种方法是常用的，因为它快速、简便。例如，以MnO4－离子形式测定Mn时，Fe3＋离子由于在同一波长亦有吸收而产生干扰。这种干扰可以用加入H3PO4的方法予以消除，因为Fe3＋离子与磷酸形成了非吸收的磷酸盐络合物。
1.2 仪器的误差
这里所指的误差主要是读数误差和杂散光引起的误差。其他的如仪器误差、波长精度误差、非单色光和光程的不一致性等所引起的误差，这里不再赘述。
（1） 光度读数误差
在光度分析中，噪音是定量分析准确度的主要限制，因此，随机误差的主要来源在于吸光的测量。这种随机误差包括在读出T或A的刻度中，在用仪器进行测量时都可能遇到，因此相应地引起了浓度（C）的相对误差。
对多数分光光度计，根据噪音类型可分为两类情况。一类是带热检测器，属于热噪音或电子噪音；另一类是带光电发射检测器，属于散粒效应噪音仪器。
（2） 杂散光的影响
杂散光以两种形式出现，**种是杂散光的波长与测量波长相同，它可能不通过样品就射到光检测器上。这种杂散光是由于各种光学、机械零件的反射和散射引起的。**种杂散光是指从单色器出口狭缝发出的包含少量的与仪器所标示的波长不相符的光，即单色器带宽以外的光线。它是由光学系统中的缺陷引起的，如不必要的反射面，伤痕和漏光，象差和不均匀色散以及灰尘的散射等疵病。此外，也可能是由于光栅仪器中其他的衍射级所引起的。不同仪器的杂散光量都是不相等的。高性能仪器的杂散光大约为千分之几，通常情况下影响不大。但是在单色器的光谱透射率、光源的光谱强度和检测器的灵敏度相当低的时候，即在一台仪器的光谱感应的极端（如紫外一可见光分光光度计的200nm—220nm；350nm—400nm及近红外区）时，杂散光可能引起明显的误差。
在给定波长下杂散光的量，通常以测量有效强度的百分率表示1%杂散光表示Is=0.01Io，Is为杂散光强度，Io是在测定波长下透过参比液的辐射强度。在杂散光存在下所测定的透光度T观
T观= =
= （2-8）
式中，为杂散光的分数，即。假设试样对杂散光是透明的，而且Io>>Is（大于1%的杂散光是少见的），那么
T观= （2-9）
总而言之，杂散光在某些情况下可能扰乱吸收带，而使得测量结果偏离吸收定律。当杂散光也被样品吸收时，则偏离是正的，亦即观测到的吸光度大于真正值。如果杂散光不被吸收，则偏离是负的，观测值小于真正吸光度。其Δ A可由式2-10计算，
ΔA=log（1－＋10A） （2-10）
在高吸收时，由杂散光引起的吸收相对误差是相当大的。样品的透射率应大于20%，简单的稀释常常是有利的。
1.3 操作条件引起的误差
这里不列举一个操作者能引起的所有操作误差和方法误差。讨论只限制在测定过程中的三个重要方面，即吸收池的维护和使用；温度的控制；反应或测量时间的控制。除此之外，操作者也必须严格遵照操作规程所列的条件，以保证获得准确的结果。
（1） 吸收池（比色皿）的维护和使用，
在一般测定中是使用两个吸收池，一个作为参比池，另一个作为样品池。参比池装溶剂，样品池装试液，这样安排可以补偿由于溶剂的吸收所造成的误差和减少由于反射和散射所引起的误差。吸收池必须保持清洁和无伤痕。玻璃和石英吸收池通常可用冷酸或酒精、乙醚等有机溶剂清洗，避免使用重铬酸盐洗涤液，因为它会被吸附在吸收池壁上而出现一层铬化物的薄膜，这种膜很难除去。粘合的玻璃吸收池不能用酸或碱清洗，更要避免用热浓酸清洗，通常用蒸馏水漂洗，然后用少量溶液润洗，吸收池内壁不用干燥，吸收池外璧要用擦镜纸或软绸布小心擦干。测定前后要检查溶液是否有气泡、尘埃和不溶性颗粒，这些现象或物质的存在都会引起光散射。使用后必须立即清洗洁净以作备用。在任何时候用手拿时，只能拿吸收池的两毛玻璃面，不要捏在透光的两玻璃平面上，以免手上油迹沾污。吸收池内壁如果用毛织品或布料去擦，就有擦伤表面的危险，而且也很难达到清洗的目的，因此这种做法是不允许的。
（2） 温度控制
多数溶液体系的光吸收随温度的变化并不显著，因此，通常温度对吸收测定是个次要问题，大多数的分析工作可不必进行温度的精密控制。然而，当某些方法需要加热才能显色时，温度的控制就显得重要了，假如操作者不留心就会因显色不完全而导致误差；还必须注意到试样溶液颜色深度是否会随温度而改变的情况。某些化合物，如硫堇的吸收光谱随温度的改变有显著的差异。再如，温度对硫代氰酸铁络合物的稳定性也有显著影响。在15℃—25℃范围内，1h内络合物是稳定的，而在30℃时即使1min也不稳定。有些实验希望获得高精密度的结果，例如平衡常数或动力学方面的测定，为了消除温度的影响，须在恒温的吸收池室中进行。在一般情况下，紫外—可见光区内吸收带是随温度的增加而移向较长波长，这是因为吸收成分的振动能层将按波茨曼分布定律提高，因此，只需要较少的能量就可以将吸收成分提高到较高电子态；在红外区，吸收带通常随温度的增加而稍微移向较短波长，这是因为在较高的振动能层各振动态之间的能量稍有增加。假如吸收测定是在一个固定波长和超过一定的温度范围进行的，不论温度是上升或下降，所测得的吸光度将减少，因为谱带已移动，这时的测定已不在*大吸收处，而是在谱带的一侧。假如要获得准确的摩尔吸光系数值（譬如在0.5%之内），温度必须控制在±2℃之内。有机化合物的吸收光谱在低温下呈尖锐峰，而在常温下曲线较为平滑。
（3） 测量时间的控制
反应过程往往是较复杂的，不仅类型各异，而且受各种环境因素的影响，如反应产物显色时间的不同，络合物随时间而分解等等，这些都是常遇到的现象。例如在弱酸介质中Al3＋离子与铝试剂的反应，必须在反应15min以后才进行测定。Ag＋离子与3,3-二甲基联胺所生成的蓝色化合物，吸光度开始时逐渐增加，15min—20min后达到*大，随后15min—20min内保持恒定，过后就开始下降，因此需在显色后20min—30min进行测定。V5＋离子与铜铁试剂生成的红褐色化合物，一开始就达*大，30min后就逐渐消退。上述例子说明，在分析过程中恰当掌握*合适的测定时间是重要的。
2 测量条件的选择
分光光度法的灵敏度和准确度与实验技术和条件有密切关系。在探索建立一个新的分光光度分析法或改进原有分光光度分析方法时，亦需反复实验选择*佳实验技术和条件。在实验选择分析条件时，由于影响因素较多，可采用多因素优选法，如正交法或单纯形法。
2.1 pH值的选择
在分光光度法的定量分析中，为了选择确定*适宜酸度，考虑到酸度值往往是*主要的影响因素，可用单因素实验法。常用的方法是：将具有不同pH值但含有同一量的被测物质的一系列溶液，于分光光度计上测量其相应吸光度值，然后以吸光度对溶液的pH或酸度作图，得一酸度曲线。该曲线中吸光度值*大且保持不变的区间所对应的pH值范围，即为待测物质分光光度测定的*适宜酸度范围。
2.2 溶剂的选择
如果待测物质是显色测定，应尽量采用水作为溶剂以求简便，并防止分析人员长期使用某些有机溶剂而中毒。如果水相介质测定达不到分析目的时（例如灵敏度差、干扰无法消除等），则考虑使用有机溶剂或用萃取—分光光度法。
2.3 温度的选择
温度变化不大时，对分光光度法的影响甚微，故在定量分析中通常不必恒温。但若我们利用显色反应将待测物质转化为有色化合物进行测定，则温度对于显色反应速度可能有较大影响，故需控制适宜温度使反应进行完全，而且也必须考虑在该温度下待测物质、显色剂及有色络合物的稳定性。一般说来，显色反应多在室温下完成。对于速度较慢的显色反应宜选择较高温度以缩短显色时间。对于不同的显色反应应选择各自的适宜显色温度。
2.4 测定时间的选择
有色化合物稳定的时间范围按下法确定：在加入显色剂后，连续测量和记录该溶液的吸光度值。并以吸光度值对时间作图绘出“时间曲线”。该曲线的平台区（即吸光度恒定不变的区间）所对应的时间区间即为该有色化合物稳定的时间范围。吸光度的测定应在此时间范围内尽快完成。
2.5 入射光波长的选择
根据朗伯—比耳定律可知，在一定波长下，如果液槽厚度保持不变，则溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。根据式2-11：
log （2-11）
式中 ——吸光度；
——透光度；
——摩尔吸光系数，
——液层厚度；
——物质的量浓度。
上式表明，溶液的透光度并不与浓度成正比，只是log与成正比。说明在一定波长及液槽厚度保持不变的条件下，浓度与吸光度或透光度之间的关系。吸光度与浓度之间为一线性关系，而透光度却不是这种关系。因此在定量分析的实际工作中，采用吸光度，这样就避免了将换算成log的麻烦。
在实际应用中，通常借助吸收曲线来选择测定的适宜波长。所谓吸收曲线，就是使不同波长的光透过某一固定浓度的溶液，测量其吸光度。然后，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。所得曲线称为吸收曲线。吸光度值*大时的波长以λ*大表示，此波长即为测定时所选用的入射光波长，此时的摩尔吸光系数*大，测定灵敏度*高。但有时为避免干扰，不选择*大吸收波长，而选择其次的吸收峰为工作波长，这样虽然灵敏度不是*高，但能避免干扰，提高了方法的选择性。
2.6 相对误差与吸光度的关系
分光光度计都有一定的测量误差，实践证明，吸光度在0.2～0.5内测量的相对误差*小。
为使被测溶液的吸光度在0.2～0.5之内，可以用下面两种方法来调整。**是控制被测溶液的浓度，如改变取样量，改变溶液的浓缩倍数或稀释倍数。**是选择不同的比色皿，比色皿的光程长度为0.5～5.0cm（甚至10cm），吸光度小的要用长的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。例如某溶液用1cm比色皿测定时吸光度为0.05，改用5cm比色皿测定时，吸光度就变为0.25了，反过来对吸光度大的样品也可以同样调整。
2.7 参比溶液的选择
参比溶液又称为空白溶液或比较溶液。其作用在于调节分光光度计的吸光度为0（透过率100%），即标准溶液和待测溶液的吸光度相对于参比溶液而测得。
测量时选用何种参比溶液需视具体情况而定。
（1） 如被测液中，仅显色剂与待测组分生成有色化合物，而显色剂与其他试剂无色，溶液中亦无其他有色离子时，可用蒸馏水或去离子水作为参比溶液。
（2） 除显色剂与待测组分所生成的化合物有色外，溶液中亦存在其他有色离子，而且显色剂无色，此时可用不加显色剂的被测液作为参比溶液。
（3） 当显色剂本身具有颜色时，则用显色剂溶液作为参比溶液。如果显色剂和被测溶液都有色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，把被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂反应，再加入与被测溶液相等的显色剂和其他试剂，这样的参比溶液能消除共存组分的干扰。
上述原则仅适用于可见分光光度法。紫外分光光度法中可按类似原则选择，但多用有机溶剂作为参比溶液。
