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生物样品的预处理
日期：2025-05-02 11:37
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摘要：
生物样品的预处理
由于生物样品中含有大量有机物（母质），且所含有害物质一般都在痕量和超痕量级范围，因此测定前必须对样品进行分解，对欲测组分进行富集和分离，或对干扰组分进行掩蔽等。这些工作属于预处理。
一、消解和灰化
测定生物样品中的微量金属和非金属元素时，通常都要将其大量有机物基体分解，使欲测组分转变成简单的无机化合物或单质（如汞），然后进行测定。分解有机物的方法有湿法消解和干法灰化。这两种方法的基本内容在**章已介绍，此处仅结合生物样品的分解略述之。
（一）湿法消解
湿法消解生物样品常用的消解试剂体系有：硝酸-高氯酸、硝酸-硫酸、硫酸-过氧化氢、硫酸-高锰酸钾、硝酸-硫酸-五氧化二钒等。
对于含大量有机物的生物样品，特别是脂肪和纤维素含量高的样品，如肉、脂肪、面粉、稻米、秸杆等，加热消解时易产生大量泡沫，容易造成被测组分的损失。若先加硝酸，在常温下放置24h后再消解，可大大减少泡沫的产生。在某些情况下，可以加入防起泡剂（见表6-8）。
表6-8 蒸发及湿法消解样品用的防起泡剂
采用硝酸-硫酸消解法，能分解各种有机物，但对吡啶及其衍生物（如烟碱）、毒杀芬等分解不完全。样品中的卤素在消解过程中可完全损失，汞、砷、硒等有一定程度的损失。
硝酸-高氯酸消解生物样品是破坏有机物比较有效的方法，但要严格按照操作程序，防止发生爆炸。
硝酸-过氧化氢消解法应用也比较普遍，有人用该方法消解生物样品测定氮、磷、钾、硼、砷、氟等元素。
高锰酸钾是一种强氧化剂，在中性、碱性和酸性条件下都可以分解有机物。测定生物样品中汞时，用1∶1硫酸和硝酸混合液加高锰酸钾，于6O℃保温分解鱼、肉样品；用5％高锰酸钾的硝酸溶液于85℃回流消解食品和尿液；用硫酸加过量高锰酸钾分解尿样等，都可获得满意的效果。
测定动物组织、饲料中的汞，使用加五氧化二钒的硝酸和硫酸混合液催化氧化，温度可达190℃，能破坏甲基汞，使汞全部转化为无机汞。
生物样品中氮的测定，沿用凯氏消解法，即在样品中加浓硫酸消解，使有机氮转化为铵盐。为提高消解温度，加速消解过程，可在消解液中加入硫酸铜、硒粉或硫酸汞等催化剂。加硫酸钾对提高消解温度也可起到较好的效果。以—NH2及=NH形态存在的有机氮化合物，用硫酸、硝酸加催化剂消解的效果是好的，但杂环、N—N键及硝态氮和亚硝态氮不能定量转化为铵盐，可加入还原剂如葡萄糖、苯甲酸、水杨酸、硫代硫酸钠等，使消解过程中发生一系列复杂氧化还原反应，则能将硝态氮还原为氨。
用过硫酸盐（强氧化剂）和银盐（催化剂）分解尿液等样品中的有机物可获得较好的效果。
近年来，应用增压溶样法分解有机物样品和难分解的无机物样品有所发展。该方法将生物样品放入外包不锈钢壳的聚四氟乙烯坩埚内，加入混合酸或氢氟酸，在140—160℃保温2—6h，即可将有机物分解，获得清亮的样品溶液。随着聚四氟乙烯加工技术的提高，外面不用钢壳保护，已开始推广应用。
（二）灰化法
灰化法分解生物样品不使用或少使用化学试剂，并可处理较大称量的样品，故有利于提高测定微量元素的准确度。但是，因为灰化温度一般为450—550℃，不宜处理测定易挥发组分的样品。此外，灰化所用时间也较长。
根据样品种类和待测组分的性质不同，选用不同材料的坩埚和灰化温度。常用的有石英、铂、银、镍、铁、瓷、聚四氟乙烯等材质的坩埚。部分生物和食品样品的灰化温度列于表6-9。
表6-9 部分生物和食品样品的灰化温度
通常灰化生物样品不加其他试剂，但为促进分解，抑制某些元素挥发损失，常加适量辅助灰化剂，如加入硝酸和硝酸盐，可加速样品的氧化，疏松灰分，利于空气流通；加入硫酸和硫酸盐，可减少氯化物的挥发损失；加入碱金属或碱土金属的氧化物、氢氧化物或碳酸盐、醋酸盐，可防止氟、氯、砷等的挥发损失；加入镁盐，可防止某些待测组分和坩埚材料发生化学反应，抑制磷酸盐形成玻璃状熔融物包裹未灰化的样品颗粒等。但是，用碳酸盐作辅助灰化剂时，会造成汞和铊的全部损失，硒、砷和碘有相当程度的损失，氟化物、氯化物、溴化物有少量损失。表6-10列举出测定某些生物样品中氟，用干灰法分解样品加入的辅助灰化剂和控制条件。
表6-10 干灰法处理测氟生物样品的辅助灰化剂
样品灰化完全后，经稀硝酸或盐酸溶解供分析测定。如酸溶液不能将其完全溶解时，则需要将残渣加稀盐酸煮沸，过滤，然后再将残渣用碱融法灰化。也可以将残渣用氢氟酸处理，蒸干后用稀酸溶解供测定。
随着低温灰化技术的发展，使测定生物样品中易挥发元素，如砷、汞、硒、氟等取得很好的效果。高频电场激发氧灰化技术是用高频电场激发氧气产生激发态氧原子处理样品，一般在150℃以下就可使样品完全灰化。氧瓶燃烧法也是一种简易低温灰化方法。该方法将样品包在无灰滤纸中，滤纸包钩挂在绕结于磨口瓶塞的铂丝上，瓶内放入适当吸收液（如测氟用0.1mol/LNaOH溶液；测汞用硫酸-高锰酸钾溶液等），并预先充入氧气。将滤纸点燃后，迅速插入瓶内，盖严瓶塞，使样品燃烧灰化。待燃烧尽，摇动瓶内溶液，使燃烧产物溶解于吸收液，吸收液供测定。
氧弹法可用于灰化测定汞、硫、砷、氟、硒、硼、氚和14碳等组分的生物样品。将样品研成粉末并压成片，放入样品杯，装在有铂内衬的氧弹内（50—300mL，内有吸收液），旋紧盖，充入纯氧气，用电火花引发样品燃烧，燃烧产物被吸收液吸收后供测定。表6-11列举了部分生物样品灰化实例。
表6-11 氧弹法灰化生物样品实例
二、提取和浓缩
测定生物样品中的农药、石油烃、酚等有机污染物时，需要用溶剂将欲测组分从样品中提取出来，提取效率的高低直接影响测定结果的准确度。如果存在杂质干扰和待测组分浓度低于分析方法的*低检测浓度问题，还要进行净化和浓缩。
随着近代分析技术的发展，对环境样品中的污染物已从单独分析发展到多种污染物连续分析。因此，在进行污染物的提取、净化和浓缩时，应考虑到多种污染物连续分析的需要。
（一）提取方法
提取生物样品中有机污染物的方法应根据样品的特点，待测组分的性质、存在形态和数量，以及分析方法等因素选择。常用的提取方法有：振荡浸取法、组织捣碎提取法和脂肪提取器提取法。
1.振荡浸取法
蔬菜、水果、粮食等样品都可使用这种方法。将切碎的生物样品置于容器中，加入适当的溶剂，放在振荡器上振荡浸取一定时间，滤出溶剂后，用新溶剂洗涤样品滤残或再浸取一次，合并浸取液，供分析或进行分离、富集用。
2.组织捣碎提取
取定量切碎的生物样品，放入组织捣碎杯中，加入适当的提取剂，快速捣碎3—5min，过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液备用。该方法提取效果较好，应用较多，特别是从动植物组织中提取有机污染物质比较方便。
3.脂肪提取器提取
索格斯列特（Soxhlet）式脂肪提取器，简称索氏提取器或脂肪提取器，常用于提取生物、土壤样品中的农药、石油类、苯并（a）芘等有机污染物质。其提取方法是：将制备好的生物样品放入滤纸筒中或用滤纸包紧，置于提取筒内；在蒸馏烧瓶中加入适当的溶剂，连接好回流装置，并在水浴上加热，则溶剂蒸气经侧管进入冷凝器，凝集的溶剂滴入提取筒，对样品进行浸泡提取。当提取筒内溶剂液面超过虹吸管的顶部时，就自动流回蒸馏瓶内，如此重复进行。因为样品总是与纯溶剂接触，所以提取效率高，且溶剂用量小，提取液中被提取物的浓度大，有利于下一步分析测定。但该方法费时，常用作研究其他提取方法的对照比较方法。
4.直接球磨提取法
该方法用己烷作提取剂，直接将样品在球磨机中粉碎和提取，可用于提取小麦、大麦、燕麦等粮食中的有机氯及有机磷农药。由于不用极性溶剂提取，可以避免以后费时的洗涤和液-液萃取操作，是一种快速提取方法。提取用的仪器是一个50mL的不锈钢管，钢管内放两个小钢球，放入1—5g样品，加 2—8g无水硫酸钠，20mL己烷，将钢管盖紧，放在350r/min的摇转机上，粉碎提取30min即可，回收率和重现性都比较好。
选择提取剂应考虑样品中欲测有机污染物的性质和存在形式，因为生物样品中有机污染物一般含量都很低，故要求用高纯度的溶剂。例如，测定农药残留量，一般要求所用溶剂中杂质含量在10g以下。普通溶剂应进行纯化处理。
此外，提取剂还应根据“相似相溶”原理选择。如对于极性小的有机氯农药、多氯联苯等，用极性小的己烷、石油醚等提取；而对于极性较强的有机磷农药和强极性的含氧除草剂等，原则上要选用强极性溶剂提取，如二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮等。
一般认为提取剂的沸点在45—80℃之间为宜。沸点太低，容易挥发；沸点太高，不易浓缩富集，而且在浓缩时会使易挥发或热稳定性差的污染物损失。
其他，如溶剂的毒性、价格以及对检测器是否有干扰等也是应考虑的因素。
为提高提取效果，可选用单一溶剂，也可用混合溶剂。常用的提取剂有：正己烷、石油醚、乙腈、丙酮、苯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺等。常用的混合溶剂体系有：正己烷（或石油醚）- 丙酮、乙腈-水、正己烷（或石油醚）-乙醚、正己烷（或石油醚）-异丙醇、正己烷（或石油醚）-二氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、正己烷（或石油醚）-乙腈、正己烷（或石油醚）-甲醇、三氯甲烷-乙酸乙酯等。
对于含多种复杂组分样品的系统分析，还可用多种溶剂分别进行多次提取。
（二）分离
用提取剂从生物样品中提取欲测组分的同时，不可避免地会将其他相关组分提取出来。例如，用石油醚等提取有机氯农药时，也将脂肪、腊质、色素等一起提取出来。因此，在测定之前，还必须将上述杂质分离出去。常用的分离方法有：液-液萃取法、层析法、磺化法、低温冷冻法、吹蒸法、液上空间法等。
1.液-液萃取法
液-液萃取法是依据有机物组分在不同溶剂中分配系数的差异来实现分离的（见**章）。例如，农药与脂肪、蜡质、色素等一起被提取后，加入一种极性溶剂（如乙腈）振摇，由于农药的极性比脂肪、蜡质、色素要大一些，故可被乙腈萃取。经几次萃取，农药几乎完全可以与脂肪等杂质分离，达到净化的目的。农药残留量分析中的液-液萃取多属用极性溶剂从非极性溶剂中提取，为表示这种萃取方法的效果，引入了p值的概念。所谓p值是指在体积相等的两种互不相溶的溶剂中分配达平衡时某种农药存在于非极性溶剂中的份数。相应的该农药存在于极性溶剂中的份数用q值表示。显然，p+q=1。根据分配系数的概念，该情况下分配系数K可表示为如下形式：
若p值等于0.70，表明等体积分配达到平衡时，有70％的农药存在于非极性溶剂中，其余30％存在于极性溶剂中。可见，p值越小，存在于极性溶剂中的农药越多，越有利于用极性溶剂从非极性溶剂中萃取农药。表6-12列出几种常用农药在两种溶剂体系中的p值。用极性溶剂等体积多次萃取非极性溶剂中的农药，其萃取份数可用下式计算：
E非=Pn
E极=1-Pn
式中：E非——非极性溶剂中农药的份数；
E极——极性溶剂中农药的份数；
n——萃取次数。
如果用非极性溶剂多次等体积提取极性溶剂中的农药，其萃取份数计算式如下：
E极=（1-p）n
E非=1-（1-p）n
在实际工作中，有时用极性溶剂多次不等体积萃取非极性溶剂中的农药，此时按下式计算萃取率：
。
2.层析法
层析法分为柱层析法、薄层层析法、纸层析法等。其中，柱层析法在处理生物样品中用的较多。这种方法的原理是将生物样品的提取液通过装有吸附剂的层析柱，则提取物被吸附在吸附剂上，但由于不同物质与吸附剂之间的吸附力大小不同，当用适当的溶剂淋洗时，则按照一定的顺序被淋洗出来，吸附力小的组分先流出，吸附力大的组分后流出，使它们彼此得以分离。
吸附剂分为无机吸附剂和有机吸附剂。常用的无机吸附剂有硅酸镁、氧化铝、活性炭、硅藻土等；有机吸附剂有纤维素、高分子微球、网状树脂等。
用经活化的硅酸镁制备的层析柱是分离农药常用的净化柱。表6-13列出以乙醚-石油醚混合液为淋洗溶剂的硅酸镁层析柱分离各种农药的情况。说明淋洗液的极性依次增大，淋洗下来的农药极性也依次增大。
3.磺化法和皂化法
磺化法是利用提取液中的脂肪、腊质等干扰物质能与浓硫酸发生磺化反应，生成极性很强的磺酸基化合物，随硫酸层分离，而达到与提取液中农药分离的目的。然后，经洗去残留的硫酸、脱
表6-12 几种常用农药的p值(25.5℃±0.5)
表6-13 硅酸镁-乙醚-石油醚层析体系分离农药
水，得到纯化的提取液。该方法常用于有机氯农药的净化，对于易被酸分解或与之起反应的有机磷、氨基甲酸酯类农药，则不适用。
皂化法是利用油脂等能与强碱发生皂化反应，生成脂肪酸盐而将其分离的方法。例如，用石油醚提取粮食中的石油烃，同时也将油脂提取出来，如在提取液中加入氢氧化钾-乙醇溶液，油脂与之反应生成脂肪酸钾盐进入水相，而石油烃仍留在石油醚中。
4.低温冷冻法
该方法基于不同物质在同一溶剂中的溶解度随温度不同而不同的原理进行彼此分离的。例如，将用丙酮提取生物样品中农药的提取液置于-70℃的冰-丙酮冷阱中，则由于脂肪和腊质的溶解度大大降低而沉淀析出，农药仍留在丙酮中。经过滤除去沉淀，获得经净化的提取液。这种方法的*大优点是有机化合物在净化过程中不发生变化，并且有良好的分离效果。
5.吹蒸法和液上空间法
吹蒸法又称气提法，即用气体将溶解在溶液中的挥发性物质分离出来，适用于一些易挥发农药和挥发油的分离。该方法的操作过程是用乙酸乙酯提取生物样品中的农药，取相当于2g样品的提取液1mL，分四次注入Storherr管，该管内填充玻璃棉、砂子等，一般加热到180—250℃，并以600mL/min流速吹入氮气。每次进样后吹3min，*后再用250μL乙酸乙酯吹洗一次。经这样处理后，提取液中的脂肪、腊质、色素等高沸点杂质仍留在Storherr管中，农药则被氮气流携带，经聚四氟乙烯冷螺旋管收集于玻璃管中，达到分离的目的。方法快速、简便，净化一个样品约需20min。
液上空间法是根据气液平衡分配的原理与气相色谱相结合，用于生物样品中挥发性组分的分离和测定技术。将样品提取液移入密闭容器中，稍提高容器的温度，经平衡一定时间后，抽取提取液上空的气体注入色谱仪分析。如果改用吹气和疏水性吸附剂富集，再经洗脱后进行色谱分析，则检测限还可降低，但必须选择合适的吸附剂、吸附和解吸条件及气提速度。
（三）浓缩
生物样品的提取液经过分离净化后，其中的污染物浓度往往仍达不到分析方法的要求，这就需要进行浓缩。常用的浓缩方法有：蒸馏或减压蒸馏法、K-D浓缩器浓缩法、蒸发法等。其中，K-D浓缩器法是浓缩有机污染物的常用方法。
K-D浓缩器是一种高效浓缩仪器。早期的仪器在常压下浓缩，近些年加上了毛细管，可进行减压浓缩，提高了浓缩速度。生物样品中的农药、苯并（a）芘等极毒、致癌性有机污染物含量都很低，其提取液经净化分离后，都可以用这种方法浓缩。为防止待测物损失或分解，加热K-D浓缩器的水浴温度一般控制在50℃以下，*高不超过80℃。特别要注意不能把提取液蒸干。若需进一步浓缩，需用微温蒸发。如用改进后的微型Snyder柱再浓缩，可将提取液浓缩至 0.1—0.2mL。
