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水中总大肠杆菌的测定
日期：2024-05-04 05:07
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摘要：
1 原理
总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。多管发酵法的原理是根据大肠菌群**能发酵乳糖，产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，求得水样中的总大肠菌群数，实验结果以*可能数（most probable number），简称MPN表示。
2 仪器
2.1 高压蒸汽**器。
2.2 恒温培养箱，冰箱。
2.3 生物显微镜，载玻片。
2.4 酒精灯，镍铬丝接种棒。
2.5 培养皿(直径100mm)，试管(5×150mm)，小倒管，吸管(1，5，10ml)，烧杯(200，500，2000ml)，锥形瓶(500，1000ml)，采样瓶。
3 培养基及染色剂的制备
3.1 乳糖蛋白胨培养液：
将10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化钠加热溶于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2－7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管（内有倒管）中，于121℃高压**器中**15min，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液：
按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。
3.3 品红亚硫酸钠培养基
3.3.1 贮备培养基的制备
于2000mL烧杯中，先将20-30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL调节溶液pH至7.2-7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g乳糖，混匀，定量分装于250或500mL锥形瓶内，置于高压**器中，在121℃**15min，贮存与冷暗处备用。
3.3.2 平皿培养基的制备
将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用**吸管按1：50比例吸取5%碱性品红乙醇溶液，置于**空试管中；再按1：200比例称取无水亚硫酸钠，置于另一**空试管内，加**水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（**）。用**吸管吸取已**的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已**的平皿内，再冷却凝固后置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过2周。如培养基由淡红色变成深红色则不能再用。
3.4 伊红美蓝培养基制备
于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，再加入2g磷酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值至7.2-7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，加入2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）20ml和0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中）13ml，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250或500mL锥形瓶内，于121℃高压**15min，放冷至45℃左右，无菌操作下将此培养基适量倾入已**的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。
3.5 革兰氏染色剂
3.5.1 结晶紫染色液：
将20mL结晶紫乙醇饱和溶液（称取4-8g结晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸铵溶液混合并过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
3.5.2 助染剂：
将1g碘与2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至300mL。此溶液2周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。
3.5.3 脱色剂：95%乙醇。
3.5.4 复染剂：将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中待完全溶解后，加90mL蒸馏水。
4 测定步骤
4.1 生活饮用水
4.1.1 初发酵实验：在两个装有已**的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。
4.1.2 平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸，产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃培养箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落。
a.伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落：淡紫红色，中心色较深的菌落。
b.品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心颜色较深的菌落。
4.1.3 取有上述特特征的群落进行革兰氏染色
a、 用已培养18－24h的培养物涂片，涂层要薄。
b、 将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去。
c、 滴加助染剂，1min后用水洗去。
d、 滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20－30s），用水洗去。
e、 滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。
4、复发酵实验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的*典型菌落1－3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查表2-5“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。
4.2 水源水
4.2.1于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10ml水样；于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1ml水样；再于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1ml 1：10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。
4.2.2 平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。
4.2.3 根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表2-6“*可能数（MPN）表”，即求得每100ml水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，即为1L水样中的总大肠菌群数。
对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1：10、1：100、1：1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。
如果接种水的水样量不是10ml、1ml和0.1ml，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100ml的MPN值。
MPN值＝MPN指数×10（ml）/接种量*大的一管（ml）
表2-5 大肠菌群检数表
接种水样总量300ml（100ml2份，10ml 2份）
10mL水量的阳性管数 | 100mL水量的阳性瓶数 | ||
0 | 1 | 2 | |
1L水样中大肠菌群数 | 1L水样中大肠菌群数 | 1L水样中大肠菌群数 | |
0 | 3 | 4 | 11 |
1 | 3 | 8 | 18 |
2 | 7 | 13 | 27 |
3 | 11 | 18 | 38 |
4 | 14 | 24 | 52 |
5 | 18 | 30 | 70 |
6 | 22 | 36 | 92 |
7 | 27 | 43 | 120 |
8 | 31 | 51 | 161 |
9 | 36 | 60 | 230 |
10 | 40 | 69 | 230 |
表2-6 *可能数（MPN）表
（接种5份10ml水样、5份0.1ml水样时，不同阳性及阴性情况下100ml水样中**数的*可能数和95％可信限值）
出现阳性份数 | 每100ml水样中 | 95％可信 限值 | 出现阳性份数 | 每100ml水样中 | 95％可信限值 | ||||||
10ml | 1ml | 0.1ml | **数的 | 下限 | 上限 | 10ml | 1ml | 0.1ml | **数的 | 下限 | 上限 |
管 | 管 | 管 | *可能数 | 管 | 管 | 管 | *可能数 | ||||
0 | 0 | 0 | <2 | 4 | 2 | 1 | 26 | 9 | 78 | ||
0 | 0 | 1 | 2 | <0.5 | 7 | 4 | 3 | 0 | 27 | 9 | 80 |
0 | 1 | 0 | 2 | <0.5 | 7 | 4 | 3 | 1 | 33 | 11 | 93 |
0 | 2 | 0 | 4 | <0.5 | 11 | 4 | 4 | 0 | 34 | 12 | 93 |
1 | 0 | 0 | 2 | <0.5 | 7 | 5 | 0 | 0 | 23 | 7 | 70 |
1 | 0 | 1 | 4 | <0.5 | 11 | 5 | 0 | 1 | 34 | 11 | 89 |
1 | 1 | 0 | 4 | <0.5 | 11 | 5 | 0 | 2 | 43 | 15 | 110 |
1 | 1 | 1 | 6 | <0.5 | 15 | 5 | 1 | 0 | 33 | 11 | 93 |
1 | 2 | 0 | 6 | <0.5 | 15 | 5 | 1 | 1 | 46 | 16 | 120 |
2 | 0 | 0 | 5 | <0.5 | 13 | 5 | 1 | 2 | 63 | 21 | 150 |
2 | 0 | 1 | 7 | 1 | 17 | 5 | 2 | 0 | 49 | 17 | 130 |
2 | 1 | 0 | 7 | 1 | 17 | 5 | 2 | 1 | 70 | 23 | 170 |
2 | 1 | 1 | 9 | 2 | 21 | 5 | 2 | 2 | 94 | 28 | 220 |
2 | 2 | 0 | 9 | 2 | 21 | 5 | 3 | 0 | 79 | 25 | 190 |
2 | 3 | 0 | 12 | 3 | 28 | 5 | 3 | 1 | 110 | 31 | 250 |
3 | 0 | 0 | 8 | 1 | 19 | 5 | 3 | 2 | 140 | 37 | 310 |
3 | 0 | 1 | 11 | 2 | 25 | 5 | 3 | 3 | 180 | 44 | 500 |
3 | 1 | 0 | 11 | 2 | 25 | 5 | 4 | 0 | 130 | 35 | 300 |
3 | 1 | 1 | 14 | 4 | 34 | 5 | 4 | 1 | 170 | 43 | 190 |
3 | 2 | 0 | 14 | 4 | 34 | 5 | 4 | 2 | 220 | 57 | 700 |
3 | 2 | 1 | 17 | 5 | 46 | 5 | 4 | 3 | 280 | 90 | 850 |
3 | 3 | 0 | 17 | 5 | 46 | 5 | 4 | 4 | 350 | 120 | 1000 |
4 | 0 | 0 | 13 | 3 | 31 | 5 | 5 | 0 | 240 | 68 | 750 |
4 | 0 | 1 | 17 | 5 | 46 | 5 | 5 | 1 | 350 | 120 | 1000 |
4 | 1 | 0 | 17 | 5 | 46 | 5 | 5 | 2 | 540 | 180 | 1400 |
4 | 1 | 1 | 21 | 7 | 63 | 5 | 5 | 3 | 920 | 300 | 3200 |
4 | 1 | 2 | 26 | 9 | 78 | 5 | 5 | 4 | 1600 | 640 | 5800 |
4 | 2 | 0 | 22 | 7 | 67 | 5 | 5 | 5 | ≥2400 | ||
